山楂水溶性膳食纤维提取工艺及结构研究

李鹏冲，李向力，尹红娜，胡桂芳，孙茜茜，刘兵戈，李娜，付有利，郑纯宇，王永，张立攀

（河南省商业科学研究所有限责任公司，河南郑州450002）

山楂是一种重要的药食两用资源，含有丰富的营养物质。相比其他水果，山楂中又含有大量的非营养物质（果胶、纤维素、木质素）等膳食纤维成分。目前对膳食纤维的保健功能已有报道：姚建军等[1]指出可以预防肠道疾病的发生，丁莎莎等[2]指出可以缓解重金属离子对人体的危害，Sushil等[3]指出可以增强胰岛素的能力等。膳食纤维是一类混合物的总称，其主要包括碳水化合物与非淀粉多糖等。邓泽丽等[4]指出利用山楂为原料进行发酵饮料营养独特。杨光等[5]指出山楂膳食纤维对小鼠有润肠通便作用。膳食纤维在溶解性方面可被分为可溶性膳食纤维与不可溶性膳食纤维，李逸鹤等[6]指出制备膳食纤维的方法主要有4类：一为化学试剂法、二为酶与化学试剂相结合通过分离的方法可制备膳食纤维、三以分子量大小为依据可通过选择性透过性膜进行分离制备的膜分离法、四为选用一定的菌种采用发酵的方法制备膳食纤维的发酵法[7]。本文采用另外一种新方法超声波辅助法来提取山楂水溶性膳食纤维，并对其结构进行分析。鉴于膳食纤维的功效以及山楂未来的发展，本试验立足于提高山楂可溶性膳食纤维的含量。为以后山楂食品的研发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂（豫北红）：郑州水果市场；纤维素酶（5×104U/g）、α-淀粉酶（0.4×104U/g）、糖化酶（1×105U/g）：上海源叶生物科技有限公司；其他试剂：盐酸、氢氧化钠、无水乙醇等化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

KQ-700DE型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；BSA224S-CW电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FCD-3000型电热恒温鼓风干燥箱：河南兄弟仪器设备有限公司；XQ200克型多功能高速粉碎机：上海广沙工贸有限公司；YFS30×8新国标型圆形验粉筛：杭州大成光电仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；FD-1A-50真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；DELTA320pH计：瑞士梅特勒-托利多公司；PW-1710 X-射线衍射仪：荷兰菲利浦公司；JSM-6490LV扫描电子显微镜：美国FEI公司；Vertex 70傅里叶变换红外光谱仪：美国Bruker光学公司；MICROTRAC S3500型激光粒度分析仪：美国麦奇克有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 提取工艺

原料准备：将山楂一分为四，用干燥箱将样品烘干，然后用粉粹机将烘干的山楂粉粹，通过60目的筛子过筛收集。准确称取0.25 g山楂粉末倒入烧杯中。按照以下试验设计处理：（1）回流脱脂；（2）加入α-淀粉酶与糖化酶水解去淀粉并同时加入纤维素酶；（3）超声波辅助提取；（4）等电点去蛋白并低速离心取上清液；（5）醇析浓缩烘干，研磨粉粹即为山楂水溶性膳食纤维。并参考汪红等[8]的方法，采用AOAC985.29方法对山楂水溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）的纯度进行测定。

1.3.2 计算公式

式中：m为山楂水溶性膳食纤维的质量，g；M为用于试验的总的山楂粉末质量，g。

1.4 山楂水溶性膳食纤维的制备工艺条件的优化

分别选取影响因素较高的超声功率、超声时间、pH值和酶添加量进行单因素试验。在单因素试验基础上选取3个梯度水平进行正交工艺优化试验。以山楂水溶性膳食纤维（SDF）的得率为试验指标。

1.5 山楂水溶性膳食纤维的结构性质研究

1.5.1 山楂水溶性膳食纤维的扫描电子纤维的测定

参考邱礼平等[9]方法并略作修改：取适量山楂水溶性膳食纤维粉末平铺到工作台上，盖上一层导电带，其厚度约为20 nm。之后将上述样品放入真空蒸发皿中并喷金。喷金厚度50 nm左右。最后用扫描电子显微镜3 000、5 000、10 000倍下进行电镜扫描，观察颗粒形貌。

1.5.2 山楂水溶性膳食纤维的粒径分布

参考伊组涛等[10]方法并略作修改：用电子天平准确称取1.6 g山楂水溶性膳食纤维粉末，倒入25 mL小烧杯底部，添加蒸馏水使悬浊液的质量浓度为5%，在常温下将其放入超声波仪器中超声0.5 h。用激光粒度分析仪在0.1 μm～500 μm范围内分析扫描。

1.5.3 山楂水溶性膳食纤维的X-射线衍射测试

参考杨小玲等[11]方法并略作修改：准确称取山楂水溶性膳食纤维粉末0.5 g。设置相应扫描参数：电压（40 kV），电流（30 mA），选择 Cu-Ka为 X-衍射特征线，衍射角度 2θ 为 5°～40°，0.02 为扫描步长，按照上述操作重复一遍。利用软件计算山楂水溶性膳食纤维的结晶度。选择4°～35°的之间的图谱，并绘制出结晶区与无定形区的分割线，利用软件直接读出样品的结晶度。

1.5.4 山楂水溶性膳食纤维的红外光谱分析

取适量山楂水溶性膳食纤维样品与KBr按1∶100的质量比例混合。研磨均匀以后，在7 MPa的条件下，将混合样品压制成薄片，小心取出以防破碎。条件：扫描范围为400 cm-1～4 000 cm-1，扫描次数64次，分辨率4 cm-1。

1.7 统计学方法

采用Origin 7.5、GC-MS 5977和SPSS 20.0对数据整理分析

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.2.1 超声功率对山楂水溶性膳食纤维得率的影响

图1所示在超声时间8min、pH值5、加酶量0.4%的条件下，设置超声功率 140、200、260、320、380 W。

图1 超声功率对水溶性膳食纤维得率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of soluble dietary fiber

从图1中可看出，超声功率上升至320 W以前，水溶性膳食纤维的得率上升趋势与其保持一致，过后水溶性膳食纤维的提取得率随超声功率的增加而下降。原因可能是大功率下使得山楂提取液变得有些黏稠进而难以提取[12]；或随着超声功率的增大使得细胞破裂致小分子内容物释出[13]。因此超声功率选择320 W左右为宜。

2.2.2 pH值对山楂水溶性膳食纤维得率的影响

图2所示在超声功率320 W、超声时间8 min、加酶量为0.4%的条件下，设置pH 值为 4.2、4.5、4.8、5.1、5.4。

从图2中可以看出，在pH值为4.2～4.5时，水溶性膳食纤维的得率随着pH值的上升趋势增加，当pH值高于4.5时，水溶性膳食纤维的提取得率逐渐降低。原因可能是在pH值4.2～4.5时纤维素酶的活性较高，高于这个pH值时活性下降导致。因此pH值选择4.5左右为宜。

2.2.3 超声时间对山楂水溶性膳食纤维得率的影响

图3所示在超声功率320 W、pH4.5、加酶量0.4%的条件下，设置超声时间分别为 3、6、9、12、15 min。

图2 pH值对水溶性膳食纤维得率的影响Fig.2 Effect of pH on soluble dietary fiber yield

图3 超声时间对水溶性膳食纤维得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of soluble dietary fiber

由图3可以看出，随着超声时间的上升水溶性膳食纤维的提取得率亦呈现上升趋势，当超声时间为12 min时，水溶性膳食纤维的提取得率便开始下降。这可能是由于长时间超声时间导致不溶性膳食纤维分解进而使水溶性膳食纤维的得率下降[14]。因此超声时间选择12 min左右为宜。

2.2.4 酶添加量对山楂水溶性膳食纤维得率的影响

图4所示在超声功率320 W、超声时间12 min、pH值4.5条件下，设置酶添加量分别为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%。

图4 加酶量对溶性膳食纤维得率的影响Fig.4 Effect of enzyme content on the yield of soluble dietary fibe

图中可以看出加酶量小于0.5%时，水溶性膳食纤维的得率呈现上升趋势，当酶的添加量超过0.5%之后，水溶性膳食纤维的得率逐渐降低。原因是在适量的纤维素酶的作用下不溶性膳食纤维可转变为水溶性膳食纤维，过量的纤维素酶可使不溶性膳食纤维降解为单糖致使聚合度降低。导致部分水溶性膳食纤维无法醇沉。因此酶添加量选择在0.5%左右为宜。

2.2 山楂水溶性膳食纤维提取的正交试验

山楂水溶性膳食纤维提取的正交试验见表1～表3。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Level of orthogonal experimental factors

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal experiment design and results

表3 可溶性膳食纤维的正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results of soluble dietary fiber

由表2可知，不同因素对山楂水溶性膳食纤维得率影响大小为B超声功率、D pH值、A超声时间、C加酶量。通过方差分析超声功率值具有显著性影响，且最佳组合为 A1、B2、C2、D1；即最佳组合为超声时间：11 min、超声功率80%、加酶量：0.5%、pH值4.4。验证上述试验理论值的准确性，按照上述正交试验得到的因素值，参照提取可溶性山楂膳食纤维的方法平行3次试验其结果优于正交试验二组结果，得到水溶性膳食纤维的得率为6.12%。并测的其纯度为91.63%。

2.3 山楂水溶性膳食纤维的结构分析

2.3.1 山楂水溶性膳食纤维的形貌分析

山楂水溶性膳食纤维的形貌分析见图5。

图5 山楂水溶性膳食纤维的表观结构Fig.5 Apparent structure of water-soluble dietary fiber from hawthorn

图5中通过扫描电镜可以看出在10 000倍的电镜下山楂水溶性膳食纤维呈现明显的葡萄形状且间隙十分明显；5 000倍电镜下可以看出各种葡萄形状簇拥在一起；3 000倍电镜下看出大的葡萄形状的聚集在一块，小型葡萄形状的较为分散。

2.3.2 山楂水溶性膳食纤维的粒度分析

图6为山楂水溶性膳食纤维的粒度分布曲线，表4是山楂水溶性膳食纤维的粒度测定结果。

表4 粒度测定结果Table 4 Particle size determination results μm

图6 山楂水溶性膳食纤维的粒径分布Fig.6 Size distribution of water-soluble dietary fiber from hawthorn

从图6可以看出山楂水溶性膳食纤维在100 μm出现一个峰，呈现单峰分布近似正态分布。从表格2～4中可以看出d95值为85.6 μm相对较小，说明颗粒分布比较集中颗粒比较均匀。并且山楂水溶性膳食纤维的平均粒径为19.5 μm。

2.3.3 山楂水溶性膳食纤维的X-射线衍射结果分析X-射线衍射结果见图7。

图7 山楂水溶性膳食纤维的X-衍射图谱Fig.7 X-ray diffraction spectrum of water-soluble dietary fiber from hawthorn

该图经过5个点平滑处理，其特征衍射峰在2θ为19.56°。通过软件拟合计算出山楂水溶性膳食纤维的结晶度为13.45%。

2.3.4 山楂水溶性膳食纤维的傅里叶红外光谱分析

山楂水溶性膳食纤维的傅里叶红外光谱分析见图8。

图8 山楂水溶性膳食纤维的傅里叶红外光谱分析Fig.8 Fourier transform infrared spectroscopy analysis of water soluble dietary fiber from hawthorn

从图8可以看出，山楂水溶性膳食纤维在3450cm-1～2 900 cm-1处有一较强的吸收峰，此峰是羟基特征峰。糖类亚甲基峰的振动直接导致在2 900 cm-1～2 800 cm-1处有相一较小吸收峰。山楂水溶性膳食纤维在1 647 cm-1有一个吸收峰，直接印证了样品中含有糖醛酸。

3 结论

本试验主要对超声波辅助提取山楂水溶性膳食纤维的提取工艺与其结构性质进行研究，为以后开发山楂产品提供理论与数据支撑。主要得到了以下结论：

1）最佳工艺为超声时间：11 min、超声功率320 W、加酶量：0.5%、pH值4.4。利用最佳条件提取出的山楂水溶性膳食纤维的得率为6.12%，并测得其纯度为91.63%。

2）对山楂水溶性膳食纤维的结构分析研究：通过电镜扫描呈现葡萄状；通过粒径分析其颗粒分布集中，且平均粒径为19.5 μm；通过X-衍射分析可以得出其结晶度为13.45%；通过红外分析表明山楂水溶性膳食纤维在 3 450 cm-1～2 900 cm-1、2 900 cm-1～ 800 cm-1、1 647 cm-1、直接印证了其含有羟基、糖类亚甲基、糖醛酸等基团。