表皮生长因子和表皮生长因子受体与大鼠自然妊娠和早产的关系▲

甘国才 李慕军 吴 浪

(广西医科大学第一附属医院生殖医学研究中心，南宁市 530021，电子邮箱：652913935@qq.com)

早产是指妊娠满28周至不足37周分娩者，早产儿各项身体机能尚未发育成熟，易导致新生儿残疾和死亡。早产导致的新生儿死亡率高达5%～15%，其中约15%的早产儿死于新生儿期，在新生儿死亡中位居第二位[1-4]。因此，预测和预防早产，改善早产儿的预后和治疗是妇产科学的研究热点之一。目前，关于早产预测因子的研究有很多，包括宫颈评价、胎儿纤维连接蛋白、各类细胞因子、基质金属蛋白酶、胰岛素样生长因子结合蛋白、促肾上腺皮质激素释放激素和C反应蛋白等[5-6]。但尚无明确的指标及统一的标准预测早产。本研究通过建立SD大鼠妊娠和早产模型，探讨孕鼠模型血清、羊水表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)水平和胎盘表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)相对含量对早产的预测价值，为临床早产的预防和治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物 选取16只12～15周龄SD雌性大鼠和8只18～20周龄SD雄性大鼠，均购自广西医科大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK桂2016-0005。雌鼠体质量300～380 g，雄鼠体质量450～500 g。所有大鼠均饲养在广西医科大学实验动物中心，由专门饲养员喂养，饲养温度22℃～28℃，湿度适中，保持良好的通风环境。

1.2 分组 采用数字表法将雄鼠随机分为两组，两组轮流与雌鼠交配，同一组雄鼠的两次交配间隔时间均为3 d。交配成功后，将16只SD雌性大鼠按不同孕龄分为A、B、C、D 4个组，每组4只，其中A组为中孕组(孕12 d)，大鼠编号依次为A1～A4，B组为晚孕组(孕17 d)，依次编号为B1～B4，C组为妊娠组(孕21 d)，依次编号为C1～C4，D组为早产组(孕17 d)，依次编号为D1～D4。在大鼠背部和四肢用结晶紫标记。

1.3 主要试剂和仪器 脂多糖购自北京Solarbio科技有限公司(批号：L8880)；RNA保护液购自北京Solarbio科技有限公司(批号：SR0020)；酶联免疫吸附测定试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司(批号：239380441)；RNA反转录盒购自Thermo Scientific(批号：00621709)；TRIzol试剂购自Invitrogen公司(批号：180401)；荧光定量PCR试剂盒购自QIAGEN(批号：154045739)。PCR仪购自美国Applied Biosystems(型号：7500)。引物的设计和生产均购自维尔凯生物科技有限公司，引物信息见表1。

表1 引物信息

1.4 实验方法

1.4.1 造模方法及造模成功评价标准：把大鼠按雌雄2 ∶1合笼，合笼时间为18:00到第二天9:00。检查交配情况：(1)第二天9:00查看阴栓的同时进行阴道涂片，染色风干后立即进行镜下观察，若雌鼠阴道口有乳白色阴栓，或阴道涂片后可镜下观察到精子则视为交配成功；(2)在孕中期(孕10～14 d)，可通过深触诊摸到雌鼠下腹部串珠样胚胎，则可视为交配成功并受孕。交配成功当天视为怀孕的第1天。早产组在孕17 d的时候，给予0.04 mg/ml脂多糖腹腔注射，注射量为400 μg/kg，每3 h观察1次，若发现阴道流液或流血则视为早产。

1.4.2 标本采集：中孕组于孕第12天、晚孕组于孕第17天、妊娠组于孕第21天、早产组于孕第17天收集胎盘、羊水及静脉血标本：在解剖孕鼠取胎盘和羊水之前，先用毛细玻璃管在孕鼠眼眶内眦静脉各取静脉血2 ml；取静脉血后，经孕鼠下腹部解剖孕鼠，用5 ml注射器各抽取羊水2 ml，然后打开子宫，取胎盘若干。获取标本后，静脉血即用干燥管收集，羊水即用15 ml离心管收集，均分别于24 h内3 500 r/min离心15 min，取上层血清，分装至若干EP管后，置于-80℃冰箱保存备用。胎盘用生理盐水冲洗，立即放入RNA保护液浸泡，于24 h后取出，置于-80℃冰箱保存备用。用于苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色的胎盘则立即放入10%福尔马林溶液中浸泡，并放置于4℃冰箱保存，直至行HE染色处理。

1.4.3 检测方法：采用双抗夹心法分别检测羊水和血清中的EGF水平，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用芬兰Thermo Scientific公司生产的Multiskan GO全波长酶标仪检测吸光度，绘制标准曲线后计算待测标本含量。采用实时荧光定量PCR(realtime quantitative PCR，RT-qPCR)检测各组胎盘组织中EGFR基因含量，采用美国Applied Biosystems公司生产的PCR仪(型号：7500)检测样本中EGFR的相对表达量，采用2-ΔΔCt法计算相对定量结果。2-ΔΔCt值反映各样品相对空白组样品目的基因的相对表达水平：ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值；ΔΔCt=各样品ΔCt值-空白组ΔCt值的平均值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，相关性分析采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胎盘HE染色结果 早产组和妊娠组可见明显的血管充血，在早产组中血管之间和绒毛之间可见明显的炎症细胞浸润，表现出绒毛膜炎的病理改变。中孕组和晚孕组血管充血不明显，中孕组可见硕大的滋养叶细胞。见图1～4。

图1 早产组(HE染色,×10)图2 中孕组(HE染色,×10)图3 晚孕组(HE染色,×10)图4 妊娠组(HE染色,×10)

2.2 4组大鼠血清和羊水EGF水平比较 4组大鼠血清EGF水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中妊娠组血清EGF水平均高于早产组、中孕组和晚孕组(均P<0.05)，早产组、中孕组和晚孕组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。4组大鼠羊水EGF水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中早产组和中孕组均低于晚孕组和妊娠组(均P<0.05)，但早产组和中孕组比较、晚孕组和妊娠组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 4组大鼠血清、羊水EGF水平比较(x±s)

注：与妊娠组比较，#P<0.05；与晚孕组比较，*P<0.05；与妊娠组比较，△P<0.05。

2.3 4组大鼠胎盘EGFR相对表达量比较 4组的胎盘EGFR相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中妊娠组均高于早产组、中孕组和晚孕组(均P<0.05)，但早产组、中孕组和晚孕组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 4组大鼠EGFR相对表达量比较(x±s)

注：与妊娠组比较，#P<0.05。

2.4 血清、羊水EGF及胎盘EGFR的相关性分析 大鼠胎盘EGFR相对表达量与血清EGF水平呈正相关(r=0.759，P=0.001)，与羊水EGF水平也呈正相关(r=0.590，P=0.016)；血清EGF水平与羊水EGF水平呈正相关(r=0.570，P=0.021)。

3 讨 论

早产是引起新生儿死亡的主要原因之一[7]，部分发达国家中，约75%的新生儿第一个月的死因为早产[8]，因此，如何科学准确地预测早产是当前妇产科医生面临的主要问题之一。EGF是一种通过与细胞表面受体结合而促进细胞有丝分裂、细胞分化和胎儿肺表面活性物质合成的重要调节剂，在促进胎儿肺成熟的发育过程中具有重要作用[9]。EGF存在于大多数组织和体液中[10]，随着妊娠的进展，母体中的EGF不断变化，其在各个组织中的表达也不相同。生殖系统中的EGF及其受体EGFR由自分泌、旁分泌和内分泌途径产生，对生殖器官及生殖激素产生调控作用，从而影响性腺功能、胎儿发育及胎盘功能等。EGFR在孕早期广泛分布于胎盘的滋养层细胞中，并且通过EGFR信号通路调节人胎盘滋养层细胞增殖[11]。目前，EGF被广泛应用于流产和子宫肌瘤的研究，但EGF在预测早产方面却鲜有报道。

有研究发现，与孕中期相比，孕晚期羊水中的EGF水平增高，但在尿液中结果却相反，因此认为羊水中的EGF来源与尿液中的EGF来源是相互独立的[12]。但在本研究中，无论是血液还是羊水，妊娠组大鼠的EGF水平均高于中孕组，即越接近临产，EGF的水平反而越高，考虑可能与标本来源不同或检测方法不同有关。有研究显示，EGF、催乳素、4-羟基雌二醇联合治疗可改善小鼠胚泡植入率，但单独使用其中一个因素却无效[13]。这表明EGF在孕早期需联合其他因子一起激活相关途径才能产生生物学效应。Allen等[14]对马的妊娠过程进行研究发现，从妊娠第20天开始子宫内膜腺和内膜上皮中EGF的表达便显著增加，其受体EGFR在滋养细胞表面强烈表达，因此认为在马的妊娠过程中，母体生长因子EGF与母体和胎儿分泌的雌激素协同作用，可促进胎盘的快速生长，并且这种因子在妊娠期间持续分泌，使马能在足月时生产出较为成熟的新生儿驹。因此，无论是在羊水还是血液，EGF的含量均应逐渐升高，以促进胎盘和胎儿的不断成熟。在本研究中，我们以SD大鼠为实验对象，通过实验干预造成晚孕期大鼠早产，然后收集各组标本进行实验室检测。结果显示，妊娠组血清EGF水平均高于早产组、中孕组和晚孕组(均P<0.05)，而早产组、中孕组和晚孕组血清EGF比较差异无统计学意义(P>0.05)。早产组和中孕组羊水EGF水平均低于晚孕组和妊娠组(均P<0.05)，而早孕组和中孕组以及晚孕组和妊娠组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。妊娠组胎盘EGFR相对表达量均高于其他3组(均P<0.05)，结果与血清EGF的检测结果相近。这表明EGF和EGFR在妊娠的维持和发展中扮演着十分重要的作用，随着妊娠的发展，血液、羊水和胎盘中的EGF及其受体均逐渐升高。但当早产发生时，这种趋势却会发生改变。Armant等[15]研究结果显示，当EGF下降导致EGF信号调节系统失调时，会引起滋养细胞不能顺利侵入和重塑子宫螺旋动脉，并且会引起EGF受体拮抗剂的过表达，进而引起相关的围生期疾病。但本研究中晚孕组羊水EGF水平和妊娠组的比较却没有差异，这很可能是由于从晚孕期开始，胎儿快速走向最后的成熟阶段，使得胎儿分泌EGF增多并且逐渐接近分娩期浓度。Villanueva-García等[16]研究显示，孕19 d胎鼠的EGFR信号传导对肺成熟起重要作用，EGF及EGFR配体在肺成纤维细胞中大量表达并通过激活特异性蛋白激酶C促进胎鼠肺成熟。考虑可能由于孕晚期胎儿肺成熟需要，使羊水中的EGF含量升高甚至接近于分娩期，因此晚孕组羊水EGF水平与妊娠组水平无明显差异，而由于胎盘屏障作用，羊水中的EGF很难影响到母体血液中的EGF水平。胎盘中EGFR相对表达量与静脉血EGF浓度相近，可能提示胎盘EGFR的表达主要受血液EGF浓度的影响。

本研究中，大鼠血清EGF水平、羊水EGF水平及胎盘EGFR相对表达量之间均呈正相关(均P<0.05)。国内有研究报道，在人工流产和自然流产血清和胎盘中EGF和EGFR水平均呈同步性，即自然流产的EGF和EGFR均比人工流产低，当发生自然流产时，血液EGF含量和胎盘EGFR水平均同步下降[17-19]。有研究报道，在早产和早产性先兆子痫血清中的EGF和其配体EGFR会显著下降，这可能是机体对于早产的一种保护性反应[20]。

综上所述，EGF和EGFR在整个妊娠发展过程中不断变化，但其在不同的组织中的变化不同。在孕晚期血液和胎盘中的EGF和EGFR水平出现异常降低可能预示着早产。本研究仅在大鼠模型中进行，且样本量有限，结论具有一定的局限性，EGF和EGFR与自然妊娠和早产的关系还有待进一步研究阐明。