MicroRNA-146a表达与乳腺癌临床分子亚型的相关性研究*

付明刚，郭丽英

（新疆医科大学第一附属医院 乳腺外科，新疆 乌鲁木齐 830011）

MicroRNAs作为一类非编码因子参与人类许多基因的生理过程[1]，近年来其在肿瘤细胞中的表达影响肿瘤的侵袭性成为目前医学研究的热点之一，很多研究发现microRNAs在实体肿瘤的侵袭性上扮演着关键角色[2-3]。众所周知，乳腺癌严重危害当今社会妇女的身心健康，且发病率呈逐年增高的趋势，研究显示许多microRNAs与乳腺癌发生、进展有着紧密联系[4-5]。本研究在microRNAs固定组织稳定并可定量提取的基础上[6]，通过原位杂交技术检测185例浸润性导管癌石蜡组织中microRNA-146a（miR-146a）的表达，分析miR-146a在乳腺癌组织中的表达与不同临床分子亚型组间的差异及预后的关联，探讨其是否能成为预后判断的分子标志物。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年1月—2016年8月新疆医科大学第一附属医院185例女性乳腺癌患者石蜡组织标本，均经病理明确诊断为乳腺浸润性导管癌。入组患者均经过本院医学伦理委员会审批，纳入标准：①未接受术前新辅助化疗及新辅助内分泌治疗，具有完整的临床资料。②入组患者年龄28～72岁，中位年龄46岁。③所有患者均行乳腺癌改良根治术，术后接受表阿霉素+多西他赛（TA）3周方案6周期常规化疗（表阿霉素成人常用量为每疗程按体表面积60 mg/m2，多西他赛为75 mg/m2）。④所有石蜡标本组织切片厚约4 μm。

1.2 材料与试剂

miR-146a探针购自丹麦Exiqon公司，敏感型原位杂交试剂盒（MK1030）购自武汉博士德生物有限公司，DAB显色试剂盒及其他常规试剂购自新疆乌鲁木齐宝信生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原位杂交技术检测乳腺癌石蜡组织中miR-146a的表达 切片用脱蜡液梯度脱蜡，3%双氧水室温下处理切片10 min，蒸馏水洗2遍；室温下胃蛋白酶覆盖消化15 min，聚丁二酸丁二醇酯浸泡冲洗15 min；预杂交液37℃预杂交3 h；添加稀释浓度为40 μg/ml的miR-146a探针，原位杂交盖玻片覆盖后恒温箱37℃杂交过夜（约16 h）；2×柠檬酸钠缓冲液梯度充分洗涤；封闭液37℃封闭60 min；室温下滴加鼠抗地高辛玻片覆盖后孵育2 h，聚丁二酸丁二醇酯浸泡冲洗15 min；滴加链霉亲和素-生物素酶复合物37℃孵育20 min，聚丁二酸丁二醇酯洗3次，5 min/次；滴加生物素化过氧化物酶37℃孵育20 min，聚丁二酸丁二醇酯洗4次，5 min/次；二氨基联苯胺显色，苏木精复染，充分水洗，聚丁二酸丁二醇酯返蓝，常规酒精梯度给予脱水，经二甲苯透明后树胶封片。以上各项检测均严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.2 原位杂交及免疫组织化学结果判断 原位杂交实验结果为本院病理科高年资的病理医师进行结果评定。通过Olympus显微镜下观察评分并记录，miR-146a阳性的判定标准为：每张切片在镜下观察5个不同的高倍视野（×200），通过观察阳性染色的细胞强度及范围，记录并分析阳性标志物的强度和阳性细胞数后综合计量[7]。免疫染色强度分级计分为3个等级，1分：无染色或弱染色（淡黄色颗粒）；2分：一般强度染色（颗粒状棕黄色）；3分：强染色（颗粒状或团块状的棕褐色）；阳性细胞密度分级计分：阳性细胞数＜10%评为1分；阳性细胞数10%～50%评为2分；阳性细胞数＞50%者评为3分。每例标本最后得分综合染色强度和分布范围进行半定量分析，染色强度与积分之积为实际评分，0分为阴性（-），1分为弱阳性（+），2 ～ 3 分为阳性（++），＞3 分为强阳性（+++）[8]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计数资料以率（%）表示，比较采用Pearson χ2检验，乳腺癌分子亚型的分组两两比较采用Nemenyi秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-146a在乳腺癌组织中的表达

经原位杂交技术检测，结果显示miR-146a在细胞胞浆中表达，阳性表达产物呈颗粒状或团块状在镜下分布，依据表达强弱呈黄色分布、棕黄色或棕褐色分布。见附图。

附图 miR-146a在乳腺癌组织中的表达 （×200）

2.2 miR-146a在乳腺癌4种不同临床分子亚型中的表达

miR-146a在185例乳腺癌组织中51例表达（-），134例表达（+）。在Lumina A型中，miR-146a的阳性表达率最高，为84.0%，而在Basal-like型中miR-146a阴性表达率最高，为59.1%。经Pearson χ2检验分析，4种分子亚型组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明不同分子亚型中miR-146a表达率不全相同（见表1）。经Nemenyi秩和检验，Luminal A型相对Basal-like型阳性表达高（P＜0.05）（见表2）。

表1 miR-146a表达与乳腺癌分子亚型的关系 例（%）

表2 miR-146a表达与乳腺癌分子亚型的分组比较

3 讨论

乳腺癌的发病率在我国呈逐渐增高的趋势，随着对乳腺癌研究的不断深入，通过研究乳腺癌基因来分析乳腺癌生物学行为及预后成为一个重要的研究方向[9]。研究显示，microRNAs作为一种重要的转录后调控基因不仅在人类的多种实体肿瘤中起着关键作用，并且microRNAs的上调或者下调直接影响肿瘤的侵袭性，目前科学研究推测多种microRNAs为癌基因或抑癌基因参与人类肿瘤的发生、发展[10]，其通过影响靶基因从而在转录后水平调控对应的基因，作为重要的调节因子参与并调控相应的信号通路[11-12]。目前证实人类的miR-146a位于第5号染色体LOC285628基因上[13]，其不仅参与正常组织的各种生理活动，而且在多种实体肿瘤发生、进展阶段miR-146a的表达会发生上调或者下调[14-15]。因此，随着研究的深入，miR-146a在乳腺癌的预后判断上已成为一个重要的研究方向。

2000年，PEROU等[16]定义乳腺癌4种临床分子亚型，其分别为：Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型及Basal-like型。近年来，根据临床分子亚型的不同，选择不同的治疗方案在乳腺肿瘤学的治疗上成为一个里程碑式的革新。现代医学证实，即使相同的组织学分级和同等的病理分期，不同的临床分子亚型的患者的肿瘤侵袭性及预后也有明显的差异。因不同的临床分子亚型的乳腺癌患者有着差异性的预后结果，国内的乳腺癌诊疗指南已明确建议根据不同分子亚型的乳腺癌患者可采取相应的个体化治疗方案。

原位杂交技术通过带有标志物的核酸探针来检测对应的组织中待测核酸的表达，是对miRNAs表达的半定量分析方法之一。本研究通过原位杂交技术发现，在185例乳腺浸润性导管癌患者中，分子分型为Lumina A型中miR-146a的阳性表达率最高，而Basal-like型中miR-146a的阴性表达率最高，miR-146a在4种分子亚型组表达组间差异有统计学意义，经Nemenyi秩和进一步检验，Luminal A型相对于Basal-like型阳性表达高。众所周知，Lumina A型乳腺癌患者的预后在4种分子亚型中的预后通常最好，在本研究中发现Lumina A型乳腺癌组织中miR-146a阳性表达率最高，据此推测miR-146a的阳性表达预示预后更好；而在Basal-like型中，miR-146a的阴性表达率最高，而Basal-like型为乳腺癌分子亚型中最具侵袭性的亚型，以往研究表明乳腺癌肿瘤组织中生物标志物具有预后指导意义，而miR-146a在乳腺浸润性导管癌组织中表达与患者分子分型相关，miR-146a阳性表达预示患者有着较好的预后。

综上所述，通过185例浸润性乳腺导管癌患者的原位杂交实验提示不同分子亚型的乳腺浸润性导管癌中miR-146a表达率不全相同，其中miR-146a表达在Basal-like型与Lumina A型中的表达有差异，提示miR-146a的低表达与乳腺浸润性导管癌的侵袭性相关，本研究提示miR-146a有望成为乳腺癌预后判断的分子标志物。由于原位杂交技术为一种半定量检测，其预测价值有限，仍有待一种定量的实验进一步证实。