基于核磁共振的代谢组学技术在肉品科学中的应用

秦泽宇,王 浩,温荣欣,孔保华

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)波谱分析具有高通量、重复性高、样品处理简单和分析时间短等优点,特别适用于分析食品这种复杂体系[1]。NMR按照磁体强度可分为高场核磁共振(高分辨率)和低场核磁共振(低分辨率)。低分辨率NMR波谱技术在国内食品科学领域的研究已经相对成熟,本文不再赘述,而高分辨率NMR由于需要配备昂贵复杂的仪器,因此高分辨率NMR波谱分析技术在国内食品科学尤其肉品科学领域中的应用并不多见[2]。代谢组学是一门交叉学科,其将分析化学、有机化学、基因组学、表达组学、化学计量学和信息学等学科相互结合,分析组群指标而非单一指标,借助高通量检测和多元数据处理,具有整体观的思路,是对所有低分子量代谢物(<1500 Da)进行定性和定量分析的一种技术[3-4]。而基于NMR的代谢组学技术主要应用于生物、医药尤其是中药的研究[5]。在食品科学与工程领域,有学者成功将该技术应用于食品鉴别、食品质量控制、食品加工和贮存、预测和鉴别食品味道等方面,Fotakis[6]等利用NMR代谢组学技术鉴别了不同葡萄酒所用葡萄产地的不同,Ko[7]等利用此技术分析了酱油在不同陈化年份的代谢特征,Ye[8]等研究了加工对条斑紫菜产品的营养物质组成的影响,Wei[9]等对多种咖啡豆的味道进行了预测;在肉品科学领域,也有学者进行了相关报道[10-12]。但是整体而言,基于NMR的代谢组学技术在肉品科学的应用较少。

因为基于NMR的代谢组学技术具有诸多优点,在食品领域前景宽广。本文将从NMR以及代谢组学的基本原理、基于NMR的代谢组学技术的数据处理方法及其在肉品科学中的应用进行综述,并展望了此技术在研究动物福利对肉品质的影响和小分子代谢物对肉品质影响中的应用。

1 NMR基本原理简介及NMR波谱解析

NMR研究的对象是具有磁矩的一类特殊原子核,具有磁矩的原子核有自旋性质,具有一定的自旋量子数(I),,N=0,1,2…(取整数),I=1/2的原子核在自旋过程中核外电子云呈均匀的球形分布,核磁共振谱线较窄,因此自旋量子数是1/2的核,如1H、13C和31P是NMR的主要测试对象。无外加磁场时,核的自旋是无规则的。若将原子核置于外加磁场中,则核可以形成规则的自旋取向。外加磁场中,自旋量子数为I的核,共有2I+1个自旋取向,每个自旋取向用磁量子数m表示,m=I,I-1,I-2,0,…,-1。以1H为例,磁量子数有两个值,m=1/2,m=-1/2,也就是说1H在外加磁场B0中,核有两个自旋取向,m=1/2,自旋取向与外加磁场一致,能量较低;m=-1/2时,自旋取向与外加磁场方向相反,能量较高。在外加磁场中核发生的能级分裂是核磁共振的基础。当用特定频率的电磁波照射磁场中的1H核时,核的自旋取向就会由低能态跃迁到高能态[13-14]。

在肉品科学主要应用三种NMR波谱,根据不同的元素可以分为核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)、核磁共振碳谱(13C nuclear magnetic resonance,13C NMR)和核磁共振磷谱(31P nuclear magnetic resonance,31P NMR),这三种波谱分别可以检测含H化合物,含C化合物和含P化合物的组成和结构。下面以1H NMR为例简单解析NMR波谱,1H NMR波谱主要提供下列信息:通过峰的数目得到标志分子中磁不等价质子的种类;通过峰的强度(面积)可以得到每类质子的数目(相对);通过峰的位移(δ)的得到每类质子所处的化学环境;通过峰的裂分数得到相邻碳原子的质子数;通过耦合常数(J)确定化合物的构型[13-14]。

2 基于NMR的代谢组学技术数据处理方法

基于NMR的代谢组学技术所得的数据具有高维,小样本,高噪声等复杂特征,因此采用常规统计方法不能发现样品之间和各组之间的异同,通常采用以下两类分析方法:非监督分析方法,主成分分析法(principal component analysis,PCA)和聚类分析法(hierarchical cluster analysis,HCA);有监督分析方法,偏最小二乘法-判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)、正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal projection to latent structures discrimination analysis,OPLS-DA)。一般而言,数据处理顺序都是先利用非监督分析法直观的说明不同样品之间的差异;其次利用有监督的分析方法扩大组间差异,但是需要通过排列实验来证明模型的有效性[15]。除此之外,机器学习算法诸如随机森林(random forests,RF)和支持向量机(support vector machine,SVM)也被应用到代谢组学的数据处理方法中[16]。

3 NMR代谢组学技术在肉品科学中的应用

NMR代谢组学技术具有整体观的思路,不再局限于分析某一个或者某几个化合物,在数据处理时需要运用多元统计分析,不仅从整体上区分不同样品,还能识别区分差异的特殊标志物。NMR代谢组学已经被应用于确定原料肉产地的问题、区分不同品种的原料肉、不同年龄肉畜的原料肉、不同饲料喂养对肉品质的影响、不同成熟时间的原料肉、不同辐照强度处理过的原料肉、不同储存时间和温度对肉品质的影响和解决肉制品掺假问题。

3.1 NMR代谢组学研究宰前因素对肉品质的影响

影响肉品质的宰前因素主要包括:遗传因素,物种、品种、性别和年龄;营养因素,饲料的能量、组成和喂养方式;宰前应激因素,宰前休息、宰前禁食和宰前淋浴;原料肉的解剖学位置[17-19]。NMR代谢组学已被部分学者采用研究宰前因素对肉品质的影响。

原料肉产地不同导致肉制品和原料肉的NMR代谢组学数据不同,进而通过此技术确定原料肉产地。Shintu[20]等利用MAS-NMR区分了来自于澳大利亚、巴西、加拿大、瑞士和美国的牛肉干。通过PCA分析数据确定了不同国家的牛肉干的差异性,并且确定了部分代谢物如肌肽、酪氨酸、肉毒碱和苯丙氨酸可以作为标志物区分不同国家的牛肉干,经有监督的多元统计分析模型验证,此研究中80%的样品可以被准确地确定产地。Jung[21]等也利用NMR代谢组学区分了来源于四个不同国家的牛肉(澳大利亚、新西兰、韩国、美国),尽管样品数量有限,但是仍然显示出NMR代谢组学在此方面的潜力。

肉畜的品种、肌肉的解剖学位置和杂交种的亲本影响肉的品质。Ritota[22]等利用NMR对契安尼娜牛、玛莱玛娜牛、荷斯坦牛、美洲野牛四种牛的背最长肌、半腱肌提取物进行代谢组学分析。通过PCA和PLS-DA多元统计分析,可以辨别出每种牛的背最长肌和半腱肌的不同,并且确定了用于区分的代谢标志物。对于契安尼娜牛,代谢标志物包括甘氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、肌肽、肉毒碱、牛磺酸、乳酸、核苷酸、葡萄糖和脂肪酸;对于美洲野牛,代谢标志物包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸和脂肪酸;对于玛莱玛娜牛,代谢标志物包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、醋酸盐、丙酮酸盐、羟丁酸盐生物、肉毒碱、牛磺酸、核苷酸、肌肽和脂肪酸。NMR代谢组学技术不能区分荷斯坦牛的背最长肌和半腱肌。在更深入的研究中,将肌肉按照功能或者感官特性分类,NMR代谢组学可以提供区分不同功能或者不同感官特性的肌肉的可靠信息。Straadt[23]等利用NMR代谢组学技术研究了五种杂交猪。五种杂交猪种分别为DLY(由杜洛克猪、约克猪和长白猪杂交)、ID(伊比利亚黑猪和杜洛克猪杂交)、ILY(伊比利亚黑猪、杜洛克猪和长白猪杂交)、MD(曼格里察猪和杜洛克猪杂交)、MLY(曼格里察猪、长白猪和约克猪杂交)。经代谢组学分析,DLY肉样中肌肽和肌苷酸含量低于其余四种,但是肌苷的水平高于其余四种;不同杂交种的肉中氨基酸含量、种类不同。由于肉的理化成分以及性质决定着肉的感官特性,进而影响肉品质,因此在此研究中Straadt[23]等尝试将NMR代谢组学提供的代谢物信息与感官特性相联系来挖掘NMR代谢组学技术在此方向的潜力,但是NMR代谢组学提供的信息与肉的部分感官特性如滋味和风味没有明显的相关性。这可能是由于不同杂交猪的肉品质在风味和滋味方面没有明显的不同。但是在其他方面,如肉的嫩度和肌肽与代谢物信息有一定的相关性。

动物的年龄同样也可以对肉品质造成影响。Liu[24]等研究了鸭的年龄对于肉品质的影响,鸭分别在孵化后27、50、170、500 d进行屠宰,NMR代谢组学分析结果显示甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、延胡索酸、鹅肌肽、甜菜碱、牛磺酸和肌苷的含量与动物的年龄相关。虽然随着年龄的增长,鸭肉中的风味化合物呈现上升趋势,但是鸭肉的持水力,嫩度却呈现下降趋势,综合考虑,作者得出了屠宰年龄50 d的鸭肉质的可接受度最高,这一结论也与之前的研究者得出的结论类似[25]。

一些生物活性物质例如芝麻素具有抗氧化的能力,当添加至动物的饲料中时,可以调节动物的脂质代谢,从而影响肉品质[26]。Wagner[27]等用NMR代谢组学技术研究了在大西洋三文鱼饲料中添加芝麻素对肉品质的影响,通过PCA和OPLS-DA分析表明随着芝麻素添加量增多,对n-6脂肪酸与n-3脂肪酸比例影响越大,代谢物如葡萄糖、糖原、亮氨酸、缬氨酸、肌氨酸、肉毒碱、乳酸和核苷增加,这些代谢物与能量代谢相关,表明芝麻素影响三文鱼的能量代谢。

3.2 NMR代谢组学研究宰后因素对肉品质的影响

影响肉品质的宰后因素主要有肉的存储温度,僵直后的成熟时间,以及人工处理因素例如电刺激等等,此前已经很多研究从宏观的角度研究了宰后因素对肉品质的影响[28-30],近年来,NMR代谢组学被应用于此研究方向。

肉的成熟影响着肉的嫩度和风味,这主要因为动物屠宰后,组织蛋白酶和肌浆钙离子激活因子在熟化过程中降解了一些关键性蛋白质,破坏了原有肌肉结构,同时组织蛋白酶的水解产物改善了肉的风味[31]。为了对这些生化反应过程有更加详细的认识,研究人员应用了NMR代谢组学技术。Graham[32]等研究了成熟时间为3、7、14和21 d的牛肉的区别,经NMR代谢组学分析,不同成熟时间的牛肉氨基酸含量的不同,且随着成熟时间的增长,氨基酸含量增多,这是由于随着肉的成熟,蛋白水解所致。

Shumilina[33]等通过NMR代谢组学技术监测在0 ℃和4 ℃存贮的三文鱼代谢组所发生的变化,结果显示共有31种代谢物影响鱼的新鲜度和滋味,包括氨基酸、二肽、维生素、糖类、生物胺、以及ATP的降解产物,确定了计算鱼的新鲜度(K值)所必须的代谢物;发现生物胺与K值的关联性最强。Shumilina[11]等还通过NMR代谢组学探究了三文鱼副产品在存储期间的质量变化,得到了相同的结论。

3.3 NMR代谢组学在肉制品加工和肉制品安全问题中的应用

在肉制品加工工程中,不同的加工处理方式,对肉品质产生不同的影响,为了从分子层面识别不同的加工处理方式对肉品质的影响,近年来,NMR代谢组学技术开始被应用。辐照技术是一种杀菌处理方式,Zanardi[10,34]等利用NMR代谢组学技术分析被辐照处理的牛肉,确定了含有脂肪的辐照食品标志物2-十二烷基环己酮,但是在肉制品吸收辐射能量小于8kGy时,1H NMR检测不出2-十二烷基环己酮。高压处理是一种常见的增强肉制品品质的方式,Yang[35]等研究了高压处理对于卤肉产品质量的影响,通过NMR得到26种代谢物的信息,主要包括氨基酸类、糖类、有机酸类、核苷类以及它们的衍生物,通过PCA分析得出不同压力处理对代谢组的影响,最终得出150 MPa是最经济的改善产品质量的方式。肉制品尤其是发酵类的风干肠,成熟时间决定着最终产品的组分以及质量。Grossi[36]等利用NMR代谢组学技术分析不同成熟时间的帕尔玛火腿中的游离氨基酸组分的变化,并进行了定量。Garcia-Garcia[12]等通过西班牙风干肠在0、2、4、7、11 d NMR代谢组数据,识别了发酵期和风干-成熟期在代谢组成分方面的不同,动态监测了蛋白质、脂质和ATP的水解。

动物食品掺假问题一直是人们关注的食品安全问题,已经有多种较为成熟的肉类掺假鉴别技术,例如免疫分析法、色谱分析法和荧光定量PCR法[37]。NMR代谢组学技术快速无损的特点获得研究人员的关注,并被成功的应用于此类研究中[2]。Jakes[38]等利用NMR代谢技术以两种肉的氯仿提取物为样本区分了牛肉和马肉;无论是屠宰后的生鲜肉还是经过冻融的肉,均可以区分,这一结果表明冷冻处理不会对分析产生影响。区分两种肉的标志物为不饱和脂肪酸,马肉中的不饱和脂肪酸明显比牛肉中高,尤其是亚麻酸。此研究体现了NMR代谢组学技术应用在肉制品掺假问题中的潜力。虽然在此实验中,研究者利用的是60 MHz的低场谱仪,但是其研究思路与NMR代谢组学一致[38]。

4 结论与展望

研究已经证明NMR代谢组学在肉品科学领域具有很大实用性以及应用潜力,其可以最大限度的保证样品不被损害,并可以实现连续的、动态的监测,因而得到更详细的信息。1H NMR、13C NMR和31P NMR可以提供对肉品质的影响最大的代谢物的信息,例如乳酸、糖原、还有含磷的能量化合物,因而被成功的应用于分析这几种代谢物影响肉品质的机理。动物的宰前管理,屠宰方式影响动物的应激反应,进而影响动物的代谢,因此,NMR代谢组学技术可以在以后应用于动物福利问题当中,这正逐渐成为人们关注的热点。

NMR代谢组学技术虽然在肉品科学研究中应用较少,但是其具有整体分析的效果,而且在识别小分子生物标志物方面具有很大的潜力,正逐渐成为肉品科学中的一门新的分析方法,目前虽然通过该技术识别了一些标志物,但是这些标志物只是应用在区分产地、品种、加工方式和贮存方式等,虽然有学者尝试建立起标志物与肉的食用品质的相关性,效果并不理想,因而需要更进一步的探讨代谢物影响肉品质的机理。想要实现这一目标,则需要突破目前NMR技术和代谢组学技术的限制,因为目前经NMR识别的代谢物仍然是有限的,很多小分子代谢物并不能被识别,因此继续发展超高分辨率的NMR技术是必需的。有的学者提出了NMR技术和质谱技术联用,用质谱技术弥补NMR技术对于低丰度代谢物检测能力不足的问题,同时,也有必要建立功能完整的代谢物数据库。