豌豆功效成分及其生理活性的研究进展

孙冬阳,呼鑫荣,薛文通,*

(1.中国农业大学,北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,食品科学与营养工程学院,北京 100083；2.中国农业大学北京食品科学与营养工程学院,北京 100083)

豌豆(PisumsativumL.)又名荷兰豆、雪豆、毕豆等,是春播一年生或秋播越年生的攀缘性草本植物[1]。豌豆具有较强的耐寒性和较广的适应性,营养价值高,是集粮食生产,鲜食蔬菜、食品加工、绿肥、饲料于一体的多用途作物,具有较高的经济价值。豌豆中的营养较为全面均衡,碳水化合物约占60%,是主要的能量来源,而豌豆蛋白含量次之,含有8种人体必需氨基酸,其中赖氨酸含量最高,含硫氨基酸较低,豌豆蛋白的生物价为48%～64%,功效比为0.6～1.2,高于大豆而低于玉米、水稻、小麦、花生[2]。豌豆中含有丰富的维生素B1、B2、尼克酸、维生素C,同时又是优质钾、铁、磷等矿质营养源[3]。豌豆中除了含有这些营养成分外,还含有多肽、膳食纤维、胰蛋白酶抑制剂、酚类化合物、植物凝集素[4]等功效成分。这些功效成分具有很高的生理活性,但常常被人忽略。本文综述了近年来豌豆功效成分的提取及其生物学功能,以期为豌豆在各种食品中的应用及功能性食品的开发与研究提供科学依据。

1 豌豆功效成分提取及生理活性

1.1 豌豆多肽的提取纯化及生理活性

豌豆多肽是指以豌豆蛋白为原料,经酶水解、分离纯化后得到的与豌豆蛋白氨基酸组成基本一致的多肽混合物。豌豆多肽溶解度高、保水性好、有较强的乳化稳定性和凝胶形成性。根据功能特性可以将其分为血管紧张素转换酶抑制肽、降胆固醇肽、抗氧化肽、免疫调节肽、抗癌活性肽等[5]。目前豌豆多肽的制备方法主要为酶解法,纯化方法主要有超滤、层析、色谱分离等技术。酶解法主要是利用植物中的蛋白酶或动物体中的消化酶对豌豆蛋白进行水解,得到豌豆多肽[6],常用的酶主要有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等。

每种蛋白酶都有其特定的氨基酸识别位点,因此蛋白质在不同蛋白酶的水解下可以得到不同的酶解产物,同时同种蛋白酶在不同水解条件下,其水解程度不同,亦可得到具有不同功能特性的生物活性肽。Niehues等[7]使用胰蛋白酶水解豌豆蛋白,并将水解液依次通过超滤、排阻色谱纯化,得到分子量<10 kDa的豌豆抗菌肽,该豌豆抗菌肽可通过降低幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)对胃上皮细胞的粘附性,来降低婴幼儿对幽门螺旋杆菌的感染率。田亚平等[8]采用双酶法,将豌豆蛋白依次使用胰蛋白酶、中性蛋白酶酶解,酶解液经凝胶层析、反相层析纯化后得到的分子量<2 kDa的、活性较高的豌豆抗氧化肽,其DPPH自由基的清除能力与相同浓度下谷胱甘肽的DPPH自由基清除能力相当。朱玲[9]使用碱性蛋白酶水解豌豆蛋白,将水解液超滤后得到分子量在1 kDa以下、活性较高的豌豆ACE抑制肽,经实验发现,该活性肽具有降低高血压患者的血压的作用。Ndiaye等[10]使用嗜热菌蛋白酶对豌豆蛋白进行水解,超滤后得到分子量约为3kDa的豌豆多肽,通过实验发现其可以显著抑制TNF-α、IL-6和NO的产生,并增加IgA的数量,从而具有抗炎和免疫调节的作用。

1.2 膳食纤维的提取及生理活性

膳食纤维(dietary fiber,DF)被定义为聚合度≥3、天然存在、通过不同手段处理或人造的不被小肠中内源性水解酶水解的,对人体健康有益的可食用性碳水化合物[11]。包括木质素、纤维素、半纤维素、树胶、果胶、果胶类似物等成分[12]。按溶解性可分为水溶性膳食纤维和水不溶性膳食纤维。水不溶性纤维包括纤维素、半纤维素和木质素;水溶性纤维包括寡糖、果胶、β-葡聚糖和半乳甘露胶[13]。膳食纤维具有独特的物化性能,如其结构中存在许多亲水性基团,因而具有良好的持水力和膨胀性[14];膳食纤维结构中含有许多活性基团,它们依靠氢键或疏水键之间的相互作用产生吸附作用[15]。水溶性膳食纤维可以被肠道微生物完全发酵降解,而不溶性膳食纤维几乎不能被肠道微生物菌群发酵降解[16]。

豌豆中含有丰富的膳食纤维。近年来,对于豌豆中膳食纤维的提取大多采用酶解法。使用淀粉酶和蛋白酶对豌豆原料进行水解后即可得到豌豆不溶性膳食纤维(Pea Insoluble Dietary fiber,PIDF)[17]。邵娟娟[18]使用纤维素酶和木聚糖酶分别对豌豆皮中的水溶性膳食纤维(Pea Soluble Dietary fiber,PSDF)进行提取,在pH为4.59时添加118 U/g PIDF纤维素酶水解4.98 h,水溶性膳食纤维的得率为36.28%,pH为5.10时添加木聚糖酶水解,水溶性膳食纤维的得率为48.57%。Che等[19]以断奶仔猪为模型研究发现,长期摄入豌豆膳食纤维可以通过增加粘蛋白和sIgA的蛋白质表达,来改善结肠的屏障功能,通过改变与结肠癌、免疫反应和脂质代谢相关的基因表达和信号通路来改善哺乳动物的结肠功能。Hashemi等[20]研究发现,豌豆膳食纤维可以增加结肠中编码粘蛋白的mRNA的表达、增加血清乙酸盐和丙酸盐的浓度,从而降低高脂饮食诱导的葡萄糖不耐受大鼠的血糖浓度。有研究表明,长期摄入豌豆膳食纤维可以增加单胃动物结肠中产甲烷菌的种群多样性、数量及活性,维持肠道中较低的氢气压强,提高结肠中微生物发酵的效率,促进有机物质的降解[21]。

1.3 豌豆中胰蛋白酶抑制剂的提取及生理活性

胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor,TI)属于丝氨酸族抑制剂,是指能够抑制胰蛋白酶及其类似物活性的天然存在的一类小分子蛋白质或多肽[22]。它可以与胰蛋白酶上的丝氨酸位点结合,形成稳定的复合物使酶失活,从而起到抑制作用[23]。根据胰蛋白酶抑制剂中的反应位点数目、相对分子量及半胱氨酸含量差异,将其分为Bowman-Birk型、Kunitz型、Potato I、Potato II型及Kazal型胰蛋白酶抑制剂,豆类种子中主要是Bowman-Birk型(BBI)“双头抑制剂”和Kunitz型(KTI)“单头抑制剂”[24]。胰蛋白酶抑制剂既可防止外源蛋白酶对动植物体的损伤,又可协同内源蛋白酶调节动植物体各项生命活动[25]。

豌豆中含有较多的胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor,TI)[26],俞红恩等[27]采用非还原Gelatin-PAGE电泳法发现,豌豆中的胰蛋白酶抑制剂有13种亚型,其中以A1、A2两种亚基为主,且所得豌豆TI具有较强的高盐稳定性和热稳定性。有研究表明,采用超声辅助水浸法提取豌豆胰蛋白酶抑制剂,在料液比为1∶100 (g/mL)、超声温度50 ℃、超声功率500 W的条件下超声16 min时所得豌豆胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制活性最高,为574.54 TIU/g[28]。

作为一种抗营养因子,胰蛋白酶抑制剂可以降低胰蛋白酶活性并降低人体对营养物质的吸收。而作为一种生理活性蛋白,TI可以调节人体的许多生理代谢活动,如抑癌消炎[29]、辐射保护、降血糖[30]、抗病虫[31]、抗病毒[32]等。XY Ye等[33]使用亲和色谱、离子交换色谱、快速蛋白质液相色谱从豌豆中分离纯化出BBI型蛋白酶抑制剂,同时发现该抑制剂能够抑制HIV-1逆转录酶活性。Clemente等[34]发现,rTI1B型豌豆胰蛋白酶抑制剂可以以剂量依赖的方式来抑制HT29型结肠癌细胞的增殖。

1.4 豌豆中酚类化合物的提取及其生理活性

酚类化合物是指芳香烃中苯环上的氢原子被羟基取代所生成的化合物。包括黄酮类、酚酸类、单宁类和花色苷类化合物及其衍生物。Duenas等[35]使用甲醇-盐酸水溶液对Fidelia和ZP-840两种豌豆的种皮和子叶进行浸提,依次使用乙醚、乙酸乙酯进行萃取,将得到的提取液进行HPLC-PAD和HPLC-MS分析发现,两种豌豆中含有槲皮素,木犀草素、芹菜素苷、原花青素单体及二聚体、羟基苯甲酸、羟基肉桂酸、黄酮、黄酮醇苷、苹果酸及反式白藜芦醇-3-葡萄糖苷。Timoracká等[36]将黄色豌豆种子用酸水解后经HPLC-DAD分析发现黄色豌豆种子中含有山奈酚、芹菜素、染料木黄酮和大豆黄素四种类黄酮。

研究表明,使用丙酮-水(7∶3 v/v)混合物对豌豆种皮进行萃取、柱层析馏分,得到的提取物不但对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生的超氧阴离子自由基有较强的清除作用,同时还具有抗脂质过氧化作用[37]。Troszynska等[38]用80%甲醇水溶液对有色种皮豌豆(Coloured Varieties of Pea,Pisum sativum L.)的种皮进行浸提,之后使用乙醚萃取得到酚酸,用70%丙酮水溶液提取缩合单宁。之后使用HPLC进行分析发现,在有色种皮豌豆中含有原儿茶酸、龙胆酸、香草酸和缩合单宁。经研究发现有色种皮豌豆中的提取物对磷脂酰胆碱脂质体过氧化具有较强的抑制作用。Nemanja等[39]使用丙酮-乙酸水溶液对欧洲深色豌豆品种的种皮进行避光浸提,采用HPLC-MS对提取物中的酚类物质进行鉴定及含量测定,发现其没食子酸、表没食子儿茶素、柚皮素和芹菜素形式的总酚含量高达46.56 mg GAE/g,具有很强的抗氧化活性,同时对该提取物进行体外抗癌鉴定发现,该品种中的酚类物质对人结肠腺癌LS174、人乳腺癌MDA-MB-453、人肺癌A594和骨髓性白血病K562四种恶性细胞系有着浓度依赖性细胞毒性作用,可激活除半胱天冬酶-3依赖性细胞凋亡以外的其他细胞死亡形式,从而达到抗癌作用。

1.5 豌豆中植物凝集素的提取及其生理活性

植物凝集素是指从植物中提取的,能够凝集细胞并可以与单糖、寡糖可逆结合的非免疫来源的非酶类蛋白质[40]。根据植物凝集素的亚基特征可将其分为部分凝集素、全凝集素、超凝集素和嵌合凝集素。按结合糖的类型,植物凝集素可分为D-甘露糖或D-葡萄糖凝集素、D-半乳糖凝集素、L-岩藻糖凝集素、N-乙酰氨基葡萄糖凝集素、N-乙酰氨基半乳糖凝集素和N-乙酰神经氨酸凝集素[41]。植物凝集素具有凝集红细胞、淋巴细胞、精子、细菌,诱导细胞凋亡自噬,抗真菌、病毒、病虫害,储存营养物质等功能[42]。

针对豌豆凝集素的提取,Sitohy等[43]采用Tris-HCl-CaCl2-MgCl2-MnCl2-NaN3混合液对埃及豌豆种子(Egyptian Pisum sativum seeds)进行浸提,依次使用乙酸,NaOH对提取液进行蛋白沉淀,得到豌豆凝集素粗提物,随后使用DEAE琼脂糖柱离子交换层析和Sephadex G100柱对粗提物进行纯化得到豌豆凝集素,通过实验发现该豌豆凝集素富含羟基氨基酸但不含含硫氨基酸,可以抑制黄曲霉、绿色木霉和尖孢镰刀菌的生长。Elaassar等[44]采用相同的方法从埃及豌豆种子中纯化得到凝集素,通过体外实验发现豌豆凝集素可以通过上调P53基因的表达、诱导细胞凋亡的方式起到抗肝癌的作用。TB Ng等[45]通过DEAE纤维素阴离子交换层析、SP-Sepharose阳离子交换层析、快速蛋白液相层析(FPLC)凝胶过滤法从豌豆中分离纯化出甘露糖/葡萄糖特异性凝集素,通过实验发现该绿色豌豆凝集素可促进小鼠脾细胞的有丝分裂并可抑制HIV-1逆转录酶的活性。

2 豌豆中功效成分在食品工业中的应用

在面制品中,加入适量的豌豆膳食纤维可以增加面团持水力、延缓面包老化[46],减少面食的蒸煮损失率[47],在酥性饼干中加入豌豆膳食纤维既可改善酥性饼干的质构特性和感官品质又可增加饼干的保健功能[48]。

在肉制品中,将适量的豌豆膳食纤维加入到牛肉[49]、鸡肉[50]等肉制品中可以取代部分肉和脂肪,从而改善其营养特性和烹饪性能,在不影响其感官接受度的同时降低生产成本。经中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶解得到的豌豆肽其乳化性和起泡性均有显著提高,添加到肉糜中可以降低其蒸煮损失率,增加其粘聚性、弹性和咀嚼性,可部分代替肉糜添加到肉制品中[51]。

豌豆中含有的多肽、膳食纤维、蛋白酶抑制剂、酚类化合物、植物凝集素等功效成分,具有抗菌、抗糖尿病、抗炎、抗高胆固醇血症、抗癌和抗氧化活性的生理功能,不仅可用于开发辅助降血糖、降血压功能食品还可以用来生产天然抑菌剂、天然抗氧化剂、临床抗癌药物、抗炎症药物。

3 展望

目前研究表明,豌豆中的豌豆多肽具有较强的抗菌、抗氧化、降血压和免疫调节作用,但对其氨基酸序列、多肽结构及其与多肽活性功能之间的关系尚未完全阐明,还需进行深入探究。豌豆中的膳食纤维可以预防结肠癌并降低血糖浓度,但对其分子结构及其他功能活性仍需进一步研究。豌豆中的蛋白酶抑制剂作为一种生理活性蛋白可以抑制早期结肠癌细胞HT29的增殖及HIV-1逆转录酶活性,但对其作用机理目前仍不明确,需进行深入研究。豌豆中的酚类化合物具有抗氧化、抗癌的作用,但实验还仅限于体外抑制作用,而未对其进行体内实验探究,因此对其活性与功能之间的关系急待进一步研究。豌豆中的植物凝集素可以抑制黄曲霉、绿色木霉和尖孢镰刀菌的生长,但其抑菌机理并不明确,未来可对其抑菌机理进行深入探究。

豌豆作为一种重要的粮用作物,在我国种植广泛。但目前我国对豌豆的深加工仍集中在在蛋白、淀粉的提取及粉丝制做,而忽视了其他功效成分的开发和利用,使得豌豆的经济价值无法充分体现。因此,在未来的研究中既要对豌豆中的生物活性成分进行深入的基础性研究,探究其生理活性功能、构效关系及其作用机理,为豌豆的工业化生产应用提供强有力的理论支撑;同时应不断优化豌豆中功效成分提取工艺,使之可以应用于大规模的工业化生产;不断创新研发各种新资源豌豆功能性食品、药品、护肤品,进一步提高豌豆在食品、医药等方面的利用价值,拓展豌豆的应用前景。