细胞焦亡与肝脏缺血再灌注损伤

王小莹 综述，申丽娟△，刘作金 审校

(1.昆明医科大学基础医学院病理学教研室,昆明 650000；2.重庆医科大学附属第二医院肝胆外科,重庆 400010)

肝脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)是临床上常发生于肝叶切除术、肝移植术中因肝门阻断及其他各种因素引起的低血容量休克后的一种常见的病理生理过程，缺血再灌注不仅不能使肝功能得以恢复，反而会导致肝脏组织结构受损、肝功能损伤。长期以来人们对IRI的机制进行研究，希望通过对机制的了解对IRI的过程进行干预，以提高肝脏对缺血缺氧过程的耐受性，从而减轻肝组织的损伤[1-2]。近年来发现的细胞焦亡及其相关途径被证实存在于IRI的过程中，并通过对细胞焦亡途径的干预，可减轻IRI的程度。

1 细胞焦亡

1.1细胞焦亡 是近年来研究发现的形态学上与凋亡相似，伴随炎性反应发生的细胞程序性死亡。大量炎性因子伴随Caspase-1的活化而释放为其特征性反应。此过程趋化周围巨噬细胞，并诱导了细胞死亡。研究发现，由Caspase-1激活诱导的细胞焦亡是由一系列能形成炎性因子的模式识别受体所触发。细胞受到内源性或外源性损伤时会释放与人体自身免疫细胞通过一定数目的细菌编码的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)与识别自身的危险信号的损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)相结合。根据亚细胞定位，PRRs可分为两类：位于质膜上的跨膜蛋白Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)和C型凝集素受体(C-type lectin receptors，CLRs)；位于细胞内的蛋白，包括：RIG样受体(RIG-like receptor，RIR),AIM2样受体(AIM2-like receptor，ALR),核苷酸结合区和富含亮氨酸的重复序列(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing，NLR)蛋白。NLRs和ALRs的亚群通过识别同源配体与凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)结合，触发一种防御机制，其中炎性因子在胞质中趋化聚集以激活促炎性Caspase-1，而Caspase-1的活化，一方面对白细胞介素(IL)-1β和IL-18进行激活，Caspase-1通过切割IL-1β和IL-18前体的方式，促进其成熟与释放；另一方面因其在急慢性炎性反应该过程中使机体对感染和损伤产生全身或局部的反应，会导致细胞焦亡的发生[3-4]。

1.2细胞焦亡的途径 在哺乳动物中，NLRs与ALRs对应的炎性因子主要包括Nlrpb1、Nlrp3、Nlcr4和AIM2，当细胞受到外源性或内源性损伤时会释放大量活性氧(reactive oxy gen species,ROS)物质，与特定模式识别受体结合并将其激活是活化这类炎性因子的关键。细胞焦亡的经典途径就是这种依赖激活剂活化的炎性因子将Caspase-1活化而引起下游IL-1β与IL-18的成熟与释放的途径[5]。而细胞焦亡非经典途径则与之相反，Caspase-11(在人类为Caspase4/5)的活化并不依赖炎性激活剂。IL-1β和IL-18的成熟与释放同样可由Caspase-11的活化诱发，从而引起细胞焦亡。研究发现，革兰阴性菌表面脂多糖成分为Caspase-11的天然受体，而脂多糖(LPS)与Caspase-11相结合并将其激活是启动这一途径的必要条件。因细胞焦亡非经典途径在脓毒血症、内毒素血症等感染性疾病病程中发挥了重要作用，近年来逐渐受到重视[6]。

2 IRI

2.1概念 IRI是临床常见的并发症，常发生于肝叶切除手术，肝移植中因肝门阻断及其他因素引起的低血容量性休克后，导致局部和远端细胞损伤和器官功能障碍。目前研究认为，IRI的机制主要包括：钙稳态的失调，活性氧和氮的生成，机体微环境的改变，Kupffer细胞的活化，补体的活化。这些机制均可导致各类损伤相关模式途径的激活，从而造成肝脏组织及功能的损伤[1]。其中，已被证实Kupffer细胞的激活可引起IRI。Kupffer细胞可被活性氧、钙离子及革兰阴性菌表面的LPS激活，目前已知最强的激活物即为LPS[7-8]。而在肝脏缺血再灌注的过程中，由于肠系膜上静脉淤血造成的肠道屏障功能受损，再灌注时，肠道内细菌移位入肝，革兰阴性菌表面的LPS此时便可作为Kupffer细胞的激活物在IRI过程中发挥作用。Kupffer细胞激活后会产生大量的炎性因子如IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、核因子(NF)-κB等，炎性因子可活化肝窦内皮细胞及肝实质细胞使其产生活性氧物质及表达黏附因子，使白细胞、血小板黏附聚集，使得微循环障碍发生。同时，这些炎性因子还可激活自然杀伤性T淋巴细胞(natural killer T cells，NKT)、中性粒细胞、CD4+T淋巴细胞，造成肝组织损伤，肝细胞死亡[9-10]。

2.2IRI过程中与细胞焦亡相关的炎性因子

2.2.1NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体 是NLR家族中一种炎性蛋白，在机体免疫反应和疾病发生过程，尤其在细胞焦亡的经典途径中发挥着重要作用。ASC和Caspase蛋白酶是其标志性组成结构，当肝细胞受损时，PRRs通过与ASC结合而将NLRP3激活，使其发挥Caspase蛋白酶作用活化Caspase-1，由此启动了细胞焦亡的经典途径[11-13]。在炎性反应对IRI中作用的研究表明，在IRI模型中，NLRP3缺陷小鼠明显表现出较少的中性粒细胞迁移和组织损伤，肝功能得到一定的保护[14]。

2.2.2Caspase-1与Caspase-11 Caspase是一个高度保守的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族。可分为参与并介导细胞凋亡发生的凋亡Caspase，包括：Caspase-2、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10；以及不参与细胞凋亡而是对IL-1β前体有切割而使其活化成熟作用的炎性Caspase，包括：Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11。因此，参与到细胞焦亡这一过程中的主要是Caspase-1与Caspase-11(人类为Caspase-4/5)[15-16]。

Caspase-1是细胞焦亡途径中的特征性活化因子。在IRI过程中，Caspase-1因活化的NLRP3发挥蛋白酶作用切割其前体将其活化，从而诱发IL-1β及IL-18的成熟与释放，导致细胞焦亡的发生。HUSTED等[17]也研究证实，IRI过程与Caspase-1介导引起IL-1β、IL-18成熟释放的细胞焦亡经典途径有关。

Caspase-11是IRI过程中细胞焦亡非经典途径的重要启动因子[12，18-19]。KAYAGAKI等[20]发现，存在一种依赖于Caspase-11活化NLRP3而使IL-1β释放引起的细胞焦亡。后被称为细胞焦亡非经典途径，Caspase-11被称为非经典炎性体。在细胞核内，LPS主要通过TLR通路激活肝脏固有Kupffer细胞，TLRs被激活后，经MyD88及其下游信号分子活化NF-κB，研究发现，Caspase-11基因的5′端上游启动子区域有多个NF-κB结合位点。活化的NF-κB 可进入核内与Caspase-11基因上游的启动子结合，使Caspase-11转录增加[21-22]。另一方面，在细胞质，LPS通过内吞形式入胞，与Caspase-11直接结合并将其激活[23]。在内毒素模型中，Caspase-11-/-的小鼠被证明比野生型小鼠存活率高[24]。在肝脏缺血再灌注的过程中存在一种有别于其他脏器缺血再灌注损伤的情况：肝门的阻断造成门静脉高压，肠系膜上静脉淤血，肠壁血管通透性上升，黏膜屏障功能受损，再灌注时肠道菌移位入血，经门静脉入肝，造成内毒素血症对肝脏造成损伤。而肠道革兰阴性菌胞壁LPS成分就成了活化Caspase-11，启动IRI途径中细胞焦亡非经典途径的激动剂[25-26]。

2.2.3IL-1β与IL-18 是单核细胞、内皮细胞等多种细胞在应答内外源性损伤时产生的细胞因子，是细胞焦亡途径中最终活化并释放的特征性炎性因子。在IRI的过程中，前体pro-IL-1β和pro-IL-18经上游Caspase-1剪切并活化。活化后的IL-1β与IL-18可激活中性粒细胞、NKT细胞等免疫细胞，引发炎性反应，造成肝细胞损伤、死亡[27- 28]。

3 目前与细胞焦亡相关IRI的保护措施

IRI是目前临床上肝叶切除、肝移植等手术中最常见的并发症，其直接影响到手术治疗效果及术后患者的生存情况，甚至可以引起其他脏器的损伤[29]。Kupffer细胞的活化被证明对IRI起到了启动作用，因其活化引发的一系列炎性因子释放，形成了启动IRI中细胞焦亡途径的必要条件[28]。已知的最强Kupffer细胞激活物为LPS。目前将IRI分为两相，Ⅰ相损伤由Kupffer细胞介导为主，而Ⅱ相损伤以中性粒细胞介导为主。Ⅰ相损伤是因Kupffer细胞激活释放大量活性氧及细胞炎性因子造成的肝细胞急性损伤。Ⅱ相损伤发生于Ⅰ相损伤之后，是由于炎性因子的活化释放激活了炎性反应通路，大量活化的中性粒细胞在肝脏内聚集、黏附，不但能通过释放氧自由基、蛋白酶等对肝脏造成损害，其聚集、黏附还可因阻塞肝窦造成肝窦狭窄，加重肝脏微循环障碍，引起肝细胞损害甚至损伤肝功能[30]。目前没有发现对抗细胞焦亡的特异性药物，因此，通过抑制Kupffer细胞或抑制其释放的炎性因子，以阻止其向Ⅱ相损伤转化成为目前研究的热点。实验证明，Kupffer细胞能被其特异性抑制剂三氯化钆(GdCl3)抑制其活化，从而降低包括NLRP3、Caspase-1在内的炎性因子的表达，使得IRI减轻[31]。另外在临床上，麻醉药的预处理及缺血后处理已被证实对手术引起的缺血再灌注损伤有确切的保护作用。尤其是如异氟醚、七氟醚等卤代类吸入麻醉药，可通过抑制Caspase-1、Caspase-11及IL-1β的活化表达对IRI起保护作用，并且其起到的保护作用明显优于常用静脉麻醉药物[32]。因此，制订相关手术麻醉方案时，选择卤代类吸入麻醉药作为围术期用药对肝功能进行保护已在临床上达成共识。

综上所述，IRI过程中通过激活炎性因子引起细胞焦亡，炎性因子作为将肝脏缺血再灌注与细胞焦亡连接起来的桥梁，若可抑制其活化，无疑可阻断细胞焦亡这一通路，从而减轻IRI。因此，对细胞焦亡通路的干预调控和针对炎性因子的靶向抑制将可能为减轻IRI提供新的治疗方法。