经阴道穿刺取卵手术时间与妊娠结局的分析

王晓宁,江成龙,刁红录,张昌军

(湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心，湖北十堰 442000)

在体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)技术中,经阴道超声引导下穿刺取卵术是IVF助孕的常规收集卵子的方法。穿刺取卵术的效果与手术者取卵术熟练程度、有效的负压抽吸、穿刺取卵针直径大小、卵泡的成熟度、注射HCG时卵泡径线的大小都有关系，本中心自2014年使用经典长方案促排卵并在取卵术中使用单腔取卵针进行取卵以来,反复总结并积累经验,获卵率及回收卵母细胞质量得到较高保证。本研究对阴道超声引导下穿刺取卵术与妊娠结局的关系进行了回顾性比较，探讨经阴道穿刺取卵术中合适的取卵手术时间，减轻患者的痛苦，并获取高质量的卵母细胞，进而得到高质量的胚胎以提高临床妊娠率。

1 资料与方法

1.1研究对象 回顾性分析2014年11月至2015年11月在本院生殖医学中心因男方精子质量较差单因素寻求辅助生殖治疗的IVF-ET周期的资料共188例,纳入标准:女方年龄20～35岁;月经规则;B超监测有排卵;应用标准长方案超促排卵,并由同一医生行取卵术。其按照平均每个卵子获卵时间为1.2 min分为<1.2 min组和≥1.2 min组进行比较。

1.2方法

1.2.1促排卵方法 采用标准长方案促排卵,从上1个月经周期的黄体中期(月经第21天)开始使用醋酸曲普瑞林(德国辉凌制药有限公司)0.05 mg/d 长方案行垂体降调节,至月经第3～5天垂体降调节达标后,加用促性腺激素[Gn,重组人促卵泡刺激(r-hFSH),瑞士雪兰诺制药公司,75 IU/d]或(和)尿促性素(hMG,丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司)行超促排卵,促排卵期间B 超监测卵泡的发育情况,当直径达16～18 mm的卵泡大于2个时,停用r-hFSH和hMG,注射重组人绒促性素(r-hCG,瑞士雪兰诺制药公司)250μg,36 h 后在B超引导下行穿刺取卵术。

1.2.2取卵 患者取膀胱截石位,手术在阴道超声引导下进行。阴道B 超(日本Aloka SSD-900型超声诊断仪),阴道探头频率7 MHz； 常规消毒,铺巾,局部麻醉镇痛后放入阴道探头及穿刺架,彻底扫描盆腔,了解子宫、卵巢的位置和可及度,并确定进针位置。用单腔取卵针(美国COOK公司)，抽吸的卵泡液递进胚胎实验室由技术人员在体式显微镜下寻找卵冠丘复合体。记录取卵时间,并对所回收卵母细胞质量及胚胎质量进行评分。

1.2.3受精与胚胎培养 受精后16～18 h观察原核情况，若出现两原核判断为正常受精。受精后胚胎在体外培养24～48 h，于取卵后的第3天根据文献[1]对移植胚胎进行胚胎形态学评分，Ⅰ～Ⅱ为优质胚胎，Ⅰ～Ⅲ级胚胎均为可用胚胎，Ⅲ以上进行囊胚培养，移植D5囊胚，采用 B 超引导下的宫腔内移植。妊娠的标准是胚胎移植后第14天血清人绒毛膜促性腺激素(hCG)阳性为生化妊娠，临床妊娠为第4周B超检查有胎心搏动。优质胚胎率=优胚数/胚胎数×100%，可用胚胎率=可用胚胎数/胚胎数×100%，囊胚形成率=囊胚形成数/培养囊胚数×100%。

1.2.4激素检测 内分泌检测：控制性超促排卵周期中hCG注射日早晨抽取静脉血,应用 DXI800全自动电化学发光免疫分析系统(美国贝克曼库尔特公司) 进行内分泌(血清激素FSH、E2、P、LH)的测定。相应试剂盒购自武汉德高科技有限责任公司，操作按试剂盒说明书要求进行，控制试剂批内及批间差异10%以内。

1.2.5相关参数计算标准 可移植胚胎率=可移植胚胎数/卵裂正常受精卵数×100%。优质胚胎率=优质胚胎数/卵裂正常受精卵数×100%。流产率=流产患者数/临床妊娠患者数×100%。受精率=2原核或以上受精卵母细胞数/卵母细胞数×100%。卵裂率=卵裂正常(2原核)受精卵数/正常受精(2原核)卵母细胞数×100%。获卵率=卵母细胞数/穿刺卵泡数×100%。成熟卵率=成熟卵母细胞数/卵母细胞数×100%。

2 结 果

2.1一般情况比较 两组患者的平均年龄、不孕年限、BMI、Gn用量、Gn用药时间、移植胚胎数目差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 患者一般情况比较

2.2取卵手术时间与相关参数相关性分析 取卵手术时间与年龄、既往腹部手术史、Gn用量正相关(P<0.05)，与优胚数、取卵后孕激素水平、活产率呈负相关(P<0.05)，与BMI、Gn时间、夜针日LH、夜针日雌激素、夜针日P、取卵后LH、取卵后雌激素、临床妊娠无明显相关性(P>0.05)，见表2、3。

2.3不同妊娠结局的取卵手术时间分析 活产组每组[102例，(1.23±0.71)min]与流产组[13例，(1.49±0.61)min]相比，妊娠组[116例，(1.27±0.71)min]与非妊娠组[72例，(1.32±0.93)min]相比，取卵手术时间无明显相关性(P>0.05)。

表2 取卵手术时间与相关参数的Person相关分析

表3 取卵时间与相关参数的Spearman相关分析

2.4取卵手术时间对妊娠结局的影响 不同取卵手术时间hCG日平均FSH、E2、LH水平均差异无统计学意义(P>0．05)。<1.2 min组hCG日P水平、获卵数、获卵率、优质胚胎率显著高于≥1.2 min组，流产率显著低于≥1.2 min组(P<0．05)，见表4。

表4 不同取卵手术时间与妊娠结局比较

续表4 不同取卵手术时间与妊娠结局比较

3 讨 论

超声引导下经阴道穿刺抽吸取卵已经成为辅助生殖中获得卵子的最佳途径。但是在实际临床工作中，常常存在部分患者获卵时间长的现象，获卵时间的长短与患者自身病史、卵子成熟度、HCG作用时间、卵泡冲洗次数及操作者的熟练程度可能都有关系。

目前取卵手术使用的穿刺针分单腔和双腔两种，双腔穿刺针在使用过程中可以有一个腔抽吸卵泡液，另外一个腔抽吸卵子，但是这样可能增加卵子暴露时间，且冲洗次数不一样可能增加干扰因素[2-3]。此外，有研究表示，卵泡冲洗并不能提高有效卵子数以及有效胚胎数[4-5]。本研究选取同一方案的患者，且操作者为同一人，都是使用单腔取卵针，避免了由于客观因素引起的干扰。

已有文献证实，卵子对温度、pH 及渗透压等外界环境非常敏感,轻微的变化即可引起不可逆改变[6-8]。增加取卵手术时间，可能延长卵母细胞卵泡暴露时间,从而导致卵母细胞形态异常率增高。本研究按照纳入人群平均获取单个卵泡所需时间的平均值将其分为两组，从研究中可以发现，分组后两组的一般情况并没有明显差异。

目前国内外的研究中对于取卵手术时间与妊娠结局的影响尚少有报道，本研究中通过探讨平均每个卵子手术时间与妊娠结局的关系为临床操作提供参考，为如何提高获卵效率，改善妊娠结局奠定基础。

在本研究中发现，平均每个卵子获卵时间<1.2 min组平均获卵数、获卵率、优质胚胎率均高于≥1.2 min组，两组之间妊娠率、活产率无明显差异，分析原因可能由于这些卵子成熟度好，卵丘与卵泡壁连接疏松，容易从卵泡壁剥离下来，导致取卵容易，获卵时间短，从受精后结局来看，增加单个卵泡手术时间并不能增加获卵率、优胚率，临床妊娠率也没有明显改善，提示提高手术的熟练程度以及实验室人员的配合能力，尽量缩短手术时间可能更有利于改善助孕结局。此外，平均每个卵子获卵时间≥1.2 min组hCG日P水平增加，分析原因可能与该组患者卵泡过早黄素化有关。有研究发现，过早黄素化可能损害卵子、胚胎质量，诱导卵母细胞过早恢复减数分裂，使子宫内膜过早向分泌期转化，影响子宫内膜容受性，从而降低临床妊娠率[9-10]。本研究中并未发现临床妊娠率受到影响，但是子宫内膜容受性降低可能导致流产率增加，与文献[11]报道一致。此外，≥1.2 min组流产率增加可能与取卵手术过程中对于颗粒细胞的损伤大，取卵术后患者黄体功能相对差有关。故本研究认为，延长取卵手术时间不影响胚胎质量和妊娠结局，但当单个卵泡手术时间小于1.2 min可能提高者的胚胎质量，降低流产率。

另外需要排除不均一性的因素，如：患者卵巢功能、培养基量不同等。因此在取卵操作过程中把握每一个环节，控制在最短的时间内获得卵子，一方面需要提高取卵手术者的技能水平，另一方面促排方案的合理应用，使颗粒细胞疏松化，卵子成熟度达到同步化，才能提高取卵效率，获得理想的结局。