长链非编码RNA 与急性髓系白血病基因型多样性关系的研究进展

周晋宇，辉红蕾，尹冶，王玉明

昆明医科大学第二附属医院检验科，云南昆明650101

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种临床细胞遗传学和分子生物学高度异质性的血液恶性肿瘤，发病率3.7/10 万。成人AML 预后一般较差，只有40%的年轻患者（年龄小于60 岁）和10%的老年患者（年龄大于60 岁）获得了长期生存[1]。AML 的病理基础是由体细胞突变、细胞遗传学异常、表观遗传学改变、转录改变等致病因素引起的一系列细胞增殖、分化、凋亡的改变[2]。随着“二次攻击”理论的提出，白血病细胞遗传改变的相关研究不断增多，这些发现已被用于区分疾病分期、评估风险分层以及选择个性化治疗方案。根据欧洲白血病网络（European Leukemia Net，ELN）风险分类系统，核磷蛋白1（nucleophosmin，NPM1）、fms 样酪氨酸激酶3 内部串联重复（fms-like tyrosine kinase 3-internal tandem duplication，FLT3-ITD）及CCAAT/增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein-α,CEBPA）基因的突变为AML 患者的危险分层提供了依据。长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本超过200 个核苷酸并且缺少编码蛋白能力的基因转录产物，这些转录本在基因组印记及染色质重构、转录激活、转录干扰和细胞间信号传递等调控过程中起关键作用[3]。同时有研究运用ChIRP、RIP 和萤光素酶报告基因实验等方法揭示了lncRNA 与DNA、蛋白质以及细胞内各种RNA 之间相互作用，从而发挥功能[4]。近年来人们越来越了解lncRNA 在恶性血液病中表达失调的生物学意义，目前已有研究证实单个lncRNA 在恶性血液病的转化中发挥着重要作用[5-7]，但这些分子与AML 发病及预后相关基因型多样性的潜在关系尚未得到广泛研究。为全面揭示lncRNA 与AML 基因型多样性的关系，我们在此将对其在疾病调控网络中的重要作用做简要综述。

1 AML 患者复发基因与lncRNA 表达的关系

为了确定lncRNA 是否与细胞遗传学正常的急性髓系白血病（cytogenetically normal AML，CN-AML）老年患者的临床特征、复发性突变及预后相关，Garzon 等[8]使用自定义lncRNA 微阵列和RNA 测序（RNA-seq）分析了一批年龄较大的CNAML 患者。结果发现特定的基因突变（如NPM1、FLT3-ITD、CEBPA、IDH2、ASXL1 和RUNX1）对应特异的lncRNA 表达谱，但这些lncRNA 是否具有功能，以及它们是否直接或间接受到这些特定基因突变所促进的生物变化的调控，还需要进一步研究。由于CN-AML 年轻患者在临床特征、相关分子异常、预后方面与老年人不同，Papaioannou等[9]研究了377 例60 岁以下的CN-AML 成人患者lncRNA 表达的预后价值和生物学意义，结果显示lncRNA 表达谱为这些患者提供了独立的预后信息。在CN-AML 预后检测的多种分子改变中，NPM1 突变、FLT3-IT 突变、CEBPA 双表达阳性明显地与lncRNA 表达相关，其中CEBPA 双表达阳性与lncRNA 差异表达的相关性最强。然而，此次报道的24 种转录本与Garzon 等[8]发现的预后相关lncRNA 之间没有重叠。这一发现同时也解释了CN-AML 老年患者与年轻患者之间存在生物学差异，比如某些复发性基因突变的频率依赖于年龄的差异。此外，De Clara 等[10]报道lncRNA XLOC_109948 是一个致癌基因，低表达lncRNA XLOC_109948 的患者预后良好，特别是在NPM1 突变的CN-AML 患者中这个趋势更加明显。由此可推断出lncRNA XLOC_109948 对疾病发生发展的作用机制可能与NPM1 突变有着一定的关联。综上，AML 基因型的多样性与lncRNA 表达相互关联，既可以在基因突变的AML 患者中通过RNA-seq测序筛查出一系列与疾病进展有关的lncRNA，也可以在存在差异表达的lncRNA 的患者中找到复发基因突变的规律。

2 lncRNA 与AML 基因型多样性的关系

2.1 lncRNA HOTAIRM1 与NPM1 突变

NPM1 基因定位于染色体5q35，总长度为23 kb，编码由294 个氨基酸残基组成的核仁磷酸化蛋白。NPM1 可以穿梭于细胞核和细胞质之间，参与核糖体蛋白组装、合成、转运和中心体复制，还参与调控肿瘤抑制基因ARF-p53 通路，进而影响细胞周期和增殖[11]。NPM1 基因突变与lncRNA的差异表达密切相关。在NPM1 突变的患者中有35 个lncRNA 上调，37 个lncRNA 下调[9]。存在NPM1 突变的CN-AML 患者的lncRNA 信号强烈而独特，表现为lncRNA 折叠变化率高和错误发现率低。此外，NPM1 突变的白血病细胞具有特殊的基因表达特征，如HOXA 转录本反义RNA 髓系特异性1（HOX antisense intergenic RNA myeloid 1，HOTAIRM1）表达升高。HOTAIRM1 是由同源框基因簇（Homebox A，HOXA）产生的一种髓系特异性表达的lncRNA，定位于人类染色体7p15[12]。HOTAIRM1 由视黄酸诱导，参与全反式维甲酸（all-trans-retinoicacid，ATRA）诱导的髓样细胞系NB4 的分化。敲低HOTAIRM1 后抑制了NB4 细胞髓样分化过程中HOXA1 和HOXA4 的表达，选择性减弱了髓样分化基因CD11b 和CD18 的转录，并导致更多的细胞从G1 期进展到S 期，进而影响髓系细胞分化过程[13]。虽然与NPM1 突变相关的HOX 反义转录本的功能尚不清楚，但我们推测这些转录本可能调控重叠的HOX 蛋白编码基因或位于不同位点的其他HOX 基因，进而发挥作用。

2.2 lncRNA WT1-AS 与FLT3-ITD 突变

FLT3 基因定位于染色体13q12，其编码蛋白属于受体酪氨酸激酶（receptor-tyrosine kinase，RTK）家族，调节造血细胞的增殖、存活和分化。在约23%的AML 患者中检测到FLT3-ITD 突变，典型的临床表现为初诊时白细胞计数高，化疗敏感，诱导化疗不易缓解且易复发，预后相对较差，生存率低[14]。据报道，在已发生NPM1 突变的CNAML 患者中，约30%检测到FLT3-ITD 突变，提示两者存在一定的联系和相互作用[15]。由于NPM1和FLT3-ITD 突变经常共存，它们的lncRNA 信号有很多重叠。共有26 个与FLT3-ITD 突变相关的lncRNA 信号，其中19 个上调，7 个下调[9]。近年来研究发现FLT3-ITD 阳性患者中lncRNA WT1-AS（Wilms tumor 1 antisense RNA）高表达，并调节WT1（Wilms tumor 1 gene）蛋白水平[16]。AML 患者中lncRNA WT1 的高表达已被证实与FLT3-ITD 突变有关，而WT1-AS 是WT1 的反义转录本，其表达与WT1 内含子的甲基化有关，在体内对WT1 蛋白水平具有正向调节作用，具有抑癌活性和促癌活性。除此之外，lncRNA WT1-AS 在AML中常发生异常剪接，这可能与疾病的发生发展有关[17]。总之，通过检测携带FLT3-ITD 基因突变的AML 患者独特的lncRNA 表达信号，是开展AML发生的病理生理机制研究的新的切入点。

2.3 lncRNA NEAT1 与CEBPA 双表达阳性

CEBPA 基因定位于染色体19q13.1，全长3318 bp，编码包括356 个氨基酸残基的蛋白质，是维持造血系统粒系分化的重要转录因子。CEBPA 对于阻滞细胞周期，以及在整个造血过程中抑制自体和髓系分化至关重要。临床资料显示，5%～14%的AML 病例中CEBPA 基因发生了突变，CEBPA 突变患者初诊时外周血中血红蛋白、白细胞计数高，骨髓原始细胞比例高，血小板计数低。在不同的细胞遗传学危险分组的AML 患者中，CEBPA 的表达水平存在显著差异[18]。研究人员在CEBPA 突变的CN-AML 患者中检测到82个lncRNA 上调，186 个下调，其中lncRNA NEAT1下调最为明显[9]。核富含丰富的转录本1（nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1）是一种核限制性lncRNA，通过保留mRNA 在细胞核中进行编辑，而参与调控基因表达。它主要参与ATRA 治疗后急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）细胞的髓系分化[19]。Zeng 等[20]研究发现，lncRNA NEAT1 抑制APL 细胞的髓样分化。初发APL 患者外周血单核细胞中NEAT1 表达下调，尤其是在表达PML-RARα的细胞中表达显著降低，敲低PML-RARα后NEAT1 表达上调，表明PML-RARα能抑制NEAT1 的表达。该研究还发现，NEAT1 在ATRA 诱导的NB4 细胞分化过程中显著上调，应用小干扰RNA（siRNA）敲低NEAT1 可阻断ATRA 诱导的APL 细胞分化。此外，有研究报道lncRNA UCA1（urocancer associated 1）在CEBPA 突变的CN-AML 患者中上调。机制方面，形成了UCA1-miR-126-RAC1 调节网络，促进白血病细胞增殖，继而影响AML 进展[21]。因此，在临床工作中可以通过AML 患者是否存在CEBPA 突变来预测相关的lncRNA 表达信号，从而监测化疗效果和疾病复发。

3 lncRNA 评分的生物学意义

Papaioannou 等[9]通过测序发现了差异表达的lncRNA 后，将这些lncRNA 转录本的表达值线性组合后加权可获得预后评分，该评分与AML 患者的总生存期（overall survival，OS）、无进展生存期（event-free survival，EFS）和无病生存期（diseasefree survival，DFS）相关。良好的lncRNA 评分是较好预后的独立预测标准。在lncRNA 评分较差的患者中，调节免疫反应的基因和介导免疫逃避的基因高度表达；促进恶性细胞增殖的癌基因过表达；参与淋巴细胞/白细胞活化、炎症、损伤反应和凋亡调控的基因较为丰富；参与转录调控、RNA 代谢过程调控和DNA 结合的基因表达不足。因此，lncRNA 评分为AML 患者提供了有意义的预后信息，同时，这些lncRNA 也可作为新的分子靶标在疾病疗效评估及预后中起重要作用。

4 结语

目前研究证明AML 的致病性受遗传改变的高度影响，AML 细胞遗传学和分子的多样性使得AML 精准靶向治疗非常困难。因此，研究分子特征，将AML 患者分组细化得更精确，有助于开发更有效的治疗手段。这一领域的知识不断扩展并指导着疾病风险分层治疗决策和靶向药物的开发，正日益成为AML 现代个性化临床管理的重要组成部分。哺乳动物基因组编码成千上万的lncRNA，越来越多的证据表明某些lncRNA 可以作为预测人类癌症发生及预后的生物标志物。同时近年来发现lncRNA 与肿瘤的病理生理机制有着紧密的联系，这为进一步筛选肿瘤分子标志物奠定了基础，也为肿瘤寻找分子治疗靶标提供了依据。有研究表明，lncRNA 与血液肿瘤的恶性生物学行为明显相关，然而有关lncRNA 分子在AML 基因表达机制异常中发挥作用的研究还在起步阶段，机制尚不明确。本综述简要总结了参与AML 发病过程的常见基因突变，以及通过RNA测序获得与其突变相关联的lncRNA，将有助于进一步对AML 中的lncRNA 分子标志物进行深入研究。此外，NPM1、FLT3-ITD 突变及CEBPA 双表达阳性与疾病发生发展的全过程密切相关，同时也提示着疾病的疗效评价和预后，lncRNA 评分为AML 患者提供了有意义的预后信息，两者联合应用将更有利于疾病危险分层，为医患提供详细的诊疗信息。