肿瘤中细胞程序性死亡配体1糖基化及泛素化的调控

黎素焕，林幼玉，王清水

福建师范大学生命科学学院，福建福州350117

免疫检查点通过调控T 细胞在一定范围内活化，进而阻止过度的免疫反应以及维持机体免疫系统的稳态，因此，免疫检查点异常是肿瘤发生发展的重要原因[1]。程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDL1）是肿瘤免疫逃逸的关键免疫检查点之一[2]。T细胞激活可以诱导PD-1 的表达，而PD-L1 在多种肿瘤细胞如乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌及黑色素瘤中表达[3-4]。在肿瘤中，PD-L1 是PD-1的主要配体，肿瘤细胞利用自身表达的PD-L1 与活化的T 细胞上的受体PD-1 结合，来增加调节性T 细胞的数量或抑制其活性、下调T 细胞的活性、增强T 细胞的耐受性等途径[2,4]，实现免疫逃逸。

研究表明，糖基化、泛素化能够在翻译后水平调控PD-L1 的表达[5]。表皮生长因子（EGF）对PD-L1 糖基化的调控及细胞周期蛋白D-CDK4 对PD-L1 泛素化的调控均能影响PD-L1 与PD-1 的结合，故EGF 或D-CDK4 与其他抗肿瘤药物联用时，可以显著提高T 细胞的抗肿瘤活性[6-7]。因此，调控PD-L1 的糖基化或泛素化可能是肿瘤免疫治疗的潜在手段。在此，我们简要综述肿瘤中PD-L1 的糖基化及泛素化修饰的调控研究进展。

1 PD-1/PD-L1

PD-1 是由288 个氨基酸残基组成的Ⅰ型跨膜蛋白，胞外部分含有一个免疫球蛋白超家族结构域，胞质部分含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和一个免疫受体酪氨酸开关基序（ITSM）[4]，这2 个基序中的酪氨酸能够被磷酸化Src 同源磷酸酶1（SHP-1）和2（SHP-2）结合并磷酸化。PD-1 最先是在凋亡的T 细胞淋巴瘤中被发现的，能够介导细胞的凋亡，主要表达于活化的T 细胞、B 细胞、自然杀伤细胞等[8-9]。PD-1 对于细胞耐受性的维持和免疫系统T 细胞的调节具有重要意义[10]。PD-L1 和PD-L2 是PD-1 的2 个配体，但在肿瘤细胞中PD-1 主要的配体是PD-L1。

PD-L1 是由290 个氨基酸残基组成的Ⅰ型跨膜蛋白，含有跨膜结构域、Ig-V 和Ig-C 样细胞外结构域，以及可能不包括信号基序但在不同物种中高度保守的短细胞质结构域[11-12]。通常，PD-L1在肿瘤细胞中的表达水平高于正常体细胞[13]。最新研究发现，肿瘤细胞表达的PD-L1 不仅存在于细胞内及定位于细胞膜上，还可以以不同的形式被分泌并游离在肿瘤细胞外[14-15]。体外对肿瘤细胞进行PD-L1 转基因表达，肿瘤细胞利用PD-L1与T 细胞的PD-1 结合抑制免疫反应，使得细胞毒性T 细胞不能有效杀伤肿瘤细胞，并促进肿瘤在小鼠体内的发生和侵袭正常组织的能力[16-18]。这提示了PD-L1 是肿瘤免疫逃逸的重要免疫抑制因子。

肿瘤微环境中PD-L1 和PD-1 的表达水平比正常组织中高。当PD-L1 和PD-1 的细胞外结构域相互结合，即会诱导T 细胞募集SHP-1 和SHP-2 对PD-1 细胞内ITIM 和ITSM 基序中的酪氨酸进行磷酸化，随后抑制TCR 信号的传导途径，减少T细胞的活化[19-20]。PD-L1 和PD-1 结合也会通过抑制CD8+和Treg 等T 细胞的分化及激活，诱导T 细胞凋亡、细胞因子产生和细胞溶解活性，并进一步抑制抗肿瘤免疫[12,17,21]。

2 肿瘤细胞中PD-L1 糖基化的调控

2.1 糖基化

糖基化是发生在哺乳动物中的一种重要的翻译后修饰，膜蛋白和分泌蛋白质几乎都需要经过糖基化修饰[22]。糖基化对蛋白质的折叠、定位、细胞内转运和免疫原性具有重要的作用[17,23]。糖基化主要发生在内质网和高尔基体中，需要复杂的酶、细胞器以及成功产生碳水化合物相关翻译后修饰所需的其他因子的协同作用[22]。N-糖基化和O-糖基化是哺乳动物细胞中最常见的糖基化修饰类型[24]。

糖基化异常是恶性肿瘤细胞的一个普遍特征。与正常组织相比，肿瘤细胞通常显示出异常的糖基化修饰。糖基化异常与肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移以及免疫逃逸等关系密切[25]。黏蛋白、CD147、骨桥蛋白、α2-巨球蛋白和CD44 等蛋白质的异常糖基化修饰也被证实有助于肿瘤细胞的黏附、迁移、侵袭、增殖或免疫逃逸[24,26-29]。

2.2 PD-L1 糖基化的调控

N-糖基化在确定蛋白质结构和功能中起着关键作用。N-糖基化是膜上蛋白质-蛋白质相互作用的重要翻译后修饰，例如配体和受体之间的相互作用。N-糖基化是PD-L1 糖基化修饰的主要形式，且PD-L1 糖基化对维持其本身的稳定性至关重要[6,17]。目前，发现并确定的N-糖基化位点有N35、N192、N200 和N219，而且在这4 个位点上仅仅发生N-糖基化，其中N192、N200 和N219的N-糖基化有助于PD-L1 的稳定[6]。

肿瘤细胞中PD-L1 糖基化修饰有多种调控机制。N-糖基转移酶STT3 有2 种亚型，即STT3A和STT3B，二者协同维持肿瘤细胞PD-L1 糖基化的稳定[30]。上皮-间质转化（EMT）通过β连环蛋白转录诱导N-糖基转移酶STT3，并且随后STT3依赖的PD-L1 N-糖基化维持稳定并上调PD-L1的表达，依托泊苷可逆转这种情况[30]。Li 等描述了糖原合成酶激酶3β（GSK3β）通过b-TrCP 诱导PD-L1 的磷酸化依赖性蛋白酶体降解，而这种相互作用被N192、N200 和N219 处的PD-L1 糖基化拮抗，因此，在乳腺癌中，EGF 诱导GSK3β的失活可诱导PD-L1 的糖基化增加，以此维持PD-L1 的稳定表达[6]。β-1，3-N-乙酰葡糖胺基转移酶3（B3GNT3）是在高尔基体中表达的Ⅱ型跨膜蛋白，可在聚-N-乙酰基乳糖胺链的生物合成过程中发挥作用，并且具有调节T 细胞归巢、L-选择素配体功能和淋巴细胞运输的功能[31]。Li 等的研究表明，由于PD-L1 的N192 和N200 上的聚糖结构都含有聚-N-乙酰基乳糖胺，EGF 可通过上调B3GNT3 来增强PD-L1 糖基化[32]。另外，2-脱氧葡萄糖被证明可以作为葡萄糖类似物来降低PD-L1糖基化[33]。Cha 等也在体内外的研究中发现，PDL1 S195 磷酸化与PD-L1 4NQ 的情况一致，即S195 磷酸化后PD-L1 不能正常进行糖基化修饰，此时PD-L1 的稳定性下降[17]。

在肿瘤中，糖基化修饰不仅影响PD-L1 的稳定，而且影响PD-L1 的功能和肿瘤免疫。Li 等对PD-L1 的4 个N-糖基化位点N35、N192、N200 和N219 进行突变以及使用N-糖基化抑制剂处理野生型PD-L1，发现PD-L1 N-糖基化的改变显著降低了PD-L1 和PD-1 的结合，使T 细胞活化增加以增强抗肿瘤免疫反应，提示肿瘤免疫中的PD-1与PD-L1 相互作用需要PD-L1 的糖基化[32]。肿瘤细胞经二甲双胍处理后，PD-L1 糖基化不能正常进行，直接导致PD-1 与PD-L1 的结合显著减少，且肿瘤微环境中的细胞毒性T 细胞群体数量及活化提高，体内肿瘤的生长也被抑制[17]。2-脱氧葡萄糖及抑制EGF 降低PD-L1 的稳定性，均能破坏PD-L1 与PD-1 之间的相互作用，使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性重新恢复敏感，增强了T 细胞对肿瘤细胞的有效杀伤[32,33]。

3 肿瘤细胞中PD-L1 泛素化的调控

3.1 泛素化

泛素化调节多种复杂的细胞过程，包括蛋白质降解、蛋白质-蛋白质相互作用、受体内吞和DNA 损伤修复，是真核生物中常见的蛋白翻译后修饰[34,35]。泛素化即是在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2 及泛素连接酶E3 等一系列酶的参与下，将泛素添加到靶蛋白上[36]。细胞中不需要的或受损的蛋白质在被蛋白酶体识别并降解之前，需要被泛素化。泛素化与乙酰化和磷酸化一样，都是可逆反应，其逆向反应为去泛素化。

在癌症中，泛素化可能导致致癌途径的激活或失活。E3 连接酶和去泛素化酶可调节促癌或抑癌蛋白的活性或降解，如核因子κB（NF-κB）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（p27）和抑癌基因p53 的异常表达与癌症相关[37]。靶向泛素化E3 连接酶的抗肿瘤药物IMiDs 已获得了美国FDA的批准并应用于临床[38]。去泛素化酶的抑制剂WP1130、P5091 和B-AP15 已被证明可分别增强抗肿瘤活性、抑制肿瘤细胞的增殖以及诱导肿瘤细胞凋亡[39]。

3.2 PD-L1 的泛素化调控

PD-L1 的泛素化位点尚不清楚，但UbPred 预测软件指出PD-L1 中的2 个赖氨酸残基（K178，K281）很大可能是潜在的泛素化位点[5]。内质网相关蛋白降解的E3 连接酶HRD1 也可作为肿瘤细胞中PD-L1 泛素化的E3 连接酶[17]。目前对于PD-L1 泛素化的位点及参与泛素化过程的特异性酶的了解比较少，人们的关注点主要集中在肿瘤细胞中PD-L1 泛素化的调控机制。

细胞周期蛋白D-CDK4 是一种翻译后调控的负调控因子，可以影响PD-L1 的泛素化。DCDK4 通过诱导滞蛋白3（cullin 3）-SPOP 介导的PD-L1 泛素化来负调控PD-L1 的表达，并且CDK4/6 的抑制提高了PD-L1 表达水平，这一泛素化调控与抗PD-1/PD-L1 疗法协同可增强肿瘤免疫[7,40]。此外，COP9 信号复合体5（CSN5）作为一种致癌蛋白，具备去泛素化的活性，也是一种PD-L1 泛素化的负调控因子[41-43]。CSN5 的表达受肿瘤坏死因子α（TNF-α）的诱导，使PD-L1 去泛素化以稳定PD-L1，CSN5 抑制剂姜黄素可逆转这种情况，并提高CTLA4 阻断疗法的治疗效果[43]。CKLF 样MARVEL 跨膜结构域蛋白6（CMTM6）是一种普遍表达的蛋白质，可调控跨膜蛋白和分泌蛋白的转运。CMTM6 可结合PD-L1，并有助于PD-L1 在细胞周期中减少泛素化和溶酶体降解，诱导并稳定PD-L1 在细胞膜上的表达，增强表达PD-L1 的肿瘤细胞抑制T 细胞的能力[44]。

PD-L1 的糖基化异常，亦能使PD-L1 的泛素化增加。Li 等将PD-L1 的4 个糖基化位点N35、N192、N200 和N219 同时突变或使用衣霉素处理，使PD-L1 处于非糖基化状态，在蛋白酶体抑制剂MG132 存在下检测到非糖基化PD-L1 的泛素化明显增加[6]。此外，还发现在肿瘤细胞中，GSK3β可以通过β-TrCP 介导PD-L1 泛素化而使其被蛋白酶体降解，EGF 可以使GSK3β失活增加PD-L1的糖基化来减少PD-L1 的泛素化[6]。随后，Horita等也再次证明EGF 确实具有抑制PD-L1 的泛素化的作用[5]。二甲双胍诱导PD-L1 磷酸化，导致PD-L1 糖基化异常而使PD-L1 泛素化增加，进而诱导蛋白酶体降解，并在肿瘤微环境中增加CD8+T 细胞的活化及对肿瘤细胞的杀伤，协同CTLA4 抗体显著抑制肿瘤的生长[17]。

4 结语

肿瘤中的糖基化和泛素化异常影响肿瘤细胞的功能性，如增殖、侵袭、凋亡及肿瘤免疫等，调控肿瘤相关蛋白的糖基化或泛素化很大可能会影响肿瘤的发展或刺激免疫系统对肿瘤进行攻击，是潜在的治疗肿瘤的方法。此外，糖基化和泛素化被证明能通过影响肿瘤细胞的PD-L1的稳定和功能性而影响PD-L1 与T 细胞的PD-1的结合，从而进一步影响肿瘤微环境中T 细胞对肿瘤细胞的杀伤。目前，在临床上已有5 种抗体针对PD-1/PD-L1 这一免疫靶点治疗癌症，但抗体治疗并不能在每个肿瘤患者中都取得很好的疗效。因此，通过调控PD-L1 的糖基化和泛素化，进而破坏PD-L1 与PD-1 之间的相互作用，同时协同临床上的抗肿瘤治疗药物对肿瘤患者进行免疫治疗，可能是潜在的免疫治疗手段。