重组鸡痘病毒疫苗的研制现状

李文桂,陈雅棠

重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所，重庆400016

鸡痘病毒（Fowlpox virus，FPV）引起的鸡痘是一种禽类传染性疾病，可用FPV 的282E4 株、FP9株和TROVAC 株等减毒株进行免疫预防。鸡痘病毒的基因组大约300 kb 大小，含有250 多个开放读框（ORF），存在大量复制非必需区（nonessential region，NER），可插入25～30 kb 的外源基因而不影响鸡痘病毒的感染性，是一种有希望的疫苗载体[1-3]。pFBLacZ、pFBS7（LLEE）和pN11SEF 是鸡痘病毒的高效表达载体[4-6]，为构建重组鸡痘病毒提供了有利的工具。pSY683-EGFP、pSY681-GFP和pTKE3-EGFP 等重组质粒可以表达绿色荧光蛋白（GFP）或增强型绿色荧光蛋白（EGFP），为筛选重组鸡痘病毒提供了方便[7-9]。国内外学者报道了大量重组鸡痘病毒疫苗，这些病原体包括丙型肝炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性喉支气管炎病毒、马立克病病毒、新城疫病毒、火鸡鼻支气管炎肺病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、传染性法氏囊病病毒、Ⅰ型人类免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、禽流感病毒、人乳头瘤病毒16 型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、传染性支气管炎病毒、牛痘病毒、出血性肠炎病毒、狂犬病毒、猪园环病毒Ⅱ型、番鸭细小病毒、禽艾美球虫、鸡败血支原体、恶性疟原虫和伯氏疟原虫等。本文综述以鸡痘病毒为传递载体的病原体疫苗的研制现状。

1 重组鸡痘病毒抗黄病毒

1.1 丙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）基因组中的C 区编码P21、P19 和P16 蛋白，E 区编码GP33 和GP72 蛋白。Alvarez-laionchere 等[10]以pIDKE2 为模板扩增655 bp 的core-E1 基因，插入pFP67xgpt 得pFP67-core-E1，加FPV 的野生株转化鸡胚成纤维细胞（CEF），免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋白分子。经腹腔注射途径将2×107PFU 疫苗接种BALB/c 鼠，第一次接种后3周加强1 次，第一次接种后5 周显示脾IFN-γ+斑点形成细胞（SFCs）数目增多，此时采用腹腔注射方法用106PFU 重组牛痘病毒（VV-core-E1）进行攻击，攻击后5 d 取卵巢检查病毒负荷，结果表明免疫组的病毒负荷下降至1/100 左右。接着经肌肉注射途径将108PFU 疫苗接种非洲绿猴，第一次接种后12 和16 周加强2 次，第一次接种后18周提示血清外周血单核细胞（PBMC）数目明显增多，此时经皮下注射用107PFU 重组牛痘病毒（VV-core-E1）进行攻击，攻击后5 d 取血测定病毒负荷，结果提示免疫组血清的病毒负荷为0，而对照组血清的病毒负荷105PFU/mL。

1.2 牛病毒性腹泻病毒

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是牛病毒性腹泻的病原体之一。糖蛋白E2（GP53）是一种主要结构蛋白，可诱导宿主产生中和抗体[11]。Elahi 等[12]将pCD-GP53 与pFPV重组得pFPV-GP53，加FPV 的野生株常规转化CEF，Western 印迹提示重组病毒表达的53 kD 的GP53 蛋白可被患者的血清所结合。经足垫注射途径将4×107PFU 疫苗接种BALB/c 鼠，第一次接种后3 和6 周加强2 次，结果显示血清IgG 和中和抗体在第一次接种后6～12 周上升，第一次接种后12 周有明显提升，第一次接种后15 周提示脾细胞可分泌高水平的IFN-γ。

2 重组鸡痘病毒抗疱疹病毒

2.1 传染性喉支气管炎病毒

传染性喉支气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）是传染性喉支气管炎的病原体。糖蛋白B（gB）是高度保守的结构蛋白，是一种保护性抗原[13]。Chen 等[14]以ILTV 的GG 株总RNA 为模板扩增gB 基因，插入pSY538 得pSY538-gB，与pSY681 重组得pSY681-gB，将IL-18 基因插入得pSY681-gB-IL-18，加FPV 的017 株转化CEF，免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋白分子。经翅下刺种途径将1×106PFU 疫苗接种1 d 龄仔鸡，接种后6 周血清IgG 上升，PBMC 数目增多，流式细胞仪（FACS）检测表明CD4+T 细胞增多，此时经咽内注射方法用100 EID50传染性喉支气管炎病毒GG 株攻击，攻击后2 周免疫组和对照组的存活率分别为100%（10/10）和20%（2/10）。Tong 等[13]经翅下刺种途径将5×106PFU 的rFPV-gB/ILTV 疫苗接种42 d 龄的仔鸡，结果提示血清IgG 在接种后2～6 周上升，接种后6 周有明显提升；接种后6 周经滴鼻方法用5.6M EID50传染性喉支气管炎病毒WG 株攻击，攻击后7 d 免疫组和对照组的存活率分别为100%（5/5）和0（0/5）。

2.2 马立克病病毒

马立克病病毒（Marek′s disease virus，MDV）又称禽麻痹病毒，是马立克病的病原体，该病是常见的鸡淋巴增生性疾病，致死率较高。糖蛋白B（gB）是100 kD 的前体蛋白，可裂解为60 和49kD 的糖蛋白。PP38 是38 kD 的磷酸化蛋白，gB和PP38 蛋白均具有较好的免疫原性[16-17]。Yanagida 等[18]以pHA25 和pDC-gBdB13 为模板扩增PP38和gB 基因，分别插入pNZ1729R 得pNZ-PP38/gB，加FPV 的野生株转化CEF，Western 印迹提示重组病毒表达的38/41 kD 的PP38 和100/60/49 kD 的gB 蛋白可被患者的血清所结合。Nazerian 等[19-20]经肌肉注射途径将1×106PFU 疫苗接种1 d 龄仔鸡，接种后2 周经肌肉注射途径用103PFU 马立克病病毒RB1B 株攻击，攻击后2 周取血检查病毒负荷，结果表明rFPV-gB、rFPV-PP38 组和对照组的保护力分别为90%（9/10）、30%（3/10）和10%（1/10）。接着经翅下刺种途径将106PFU 的rFPV-gB1 疫苗接种1 d 龄仔鸡，接种后6 d 经腹腔注射用500 PFU 马立克病病毒MD5 株攻击，攻击后56 d 取血检查病毒负荷，结果提示免疫组和对照组的保护力分别为23%（4/17）和0（0/17）。

丁巧玲等[21]以pUR-MDVEgB 为模板扩增gB基因，插入pEFgpt12s 得pEF-gB，加FPV 的282E4株转化CEF；从重组病毒中抽提总RNA 作为模板，用RT-PCR 方法可克隆出2.8 kb 基因。彭大新等[22-23]将pMGB 与pFCS11 重组得pFCS11-gB，与pE/L-IFN 重组得pFCS11-gB-IFN-γ，加FPV 的282E4 株转化CEF，免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋白分子。采用皮下注射途径将1×106PFU 疫苗接种莱杭鸡，接种后8 d 经腹腔注射用500 PFU 马立克病病毒MD5 株攻击，攻击后30 d检查发病情况，结果提示免疫组和对照组的保护力分别为75%（18/24）和16.7%（4/24）。

3 重组鸡痘病毒抗副黏病毒

3.1 新城疫病毒

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是禽类新城疫的病原体，血凝素-神经氨酸酶（HN）具有血凝素和神经氨酸酶的活性，可诱导宿主产生中和抗体，具有良好的免疫原性[24-25]。Boursnell等[26]以新城疫病毒BC 株的总RNA 为模板扩增HN 基因，插入pUC19 得pUC19-HN，与pB3ME 重组得pB3ME-HN，加入FPV 的野生株转化DF1 细胞株，筛选重组病毒，Western 印迹提示重组病毒表达的66 kD 的HN 蛋白可被患者的血清所结合。采用静脉注射途径将106、104和102PFU 重组病毒分别接种3 周龄仔鸡，接种后3 周经肌肉注射途径用105ELD50新城疫病毒的有毒株攻击，攻击后16 d，106、104、102PFU 免疫组和对照组的存活率分别为100%（10/10）、60%（6/10）、30%（3/10）和0（0/10）。

3.2 火鸡鼻支气管炎肺病毒

火鸡鼻支气管炎肺病毒（Turkey rhinotracheitis pneumovirus，TRTV）是火鸡鼻支气管炎的常见病原体，该病的病亡率高达90%。融合糖蛋白F可诱导宿主产生中和抗体[27]。Yu 等[28]以TRTV 总RNA 为模板扩增F 基因，插入pKS（+）得pKS-F，与pEFL29 重组得pEFL29-F，加FPV 的野生株转化CEF，Western 印迹提示重组病毒表达的59 kD的F 蛋白可被患者的血清所结合。采用翅下刺种途径将1×105PFU 疫苗接种3 周龄火鸡，第一次接种后2 周加强1 次，血清IgG 在第一次接种后1～4 周上升，第一次接种后4 周有明显提升，在第一次接种后6 周经点眼滴鼻方法用2×105MCD50火鸡鼻支气管炎肺病毒攻击，攻击后7 d 取鼻拭子检查病毒负荷，结果提示免疫组的病毒负荷下降至1/1000 左右。

4 重组鸡痘病毒抗RNA病毒

4.1 口蹄疫病毒

口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）是家畜口蹄疫的病原体。FMDV 的3C 蛋白酶将前体蛋白P1-2A 裂解为VP0、VP1 和VP3，组装为病毒样颗粒（VLP），可诱导保护性的免疫应答[29-30]。金宁一[31]将pKS-3C 与pUTA2 重组得pUTA-3C，将pGEM-P1-2A 与pUTA-3C 重组得pUTA-P1-2A-3C，加FPV 的282E4 株转化CEF，Western 印迹提示重组病毒表达的79 kD 的P1-2A-3C 蛋白可被患者的血清所结合。经肌肉注射途径将1×107PFU 疫苗接种BALB/c 鼠，第一次接种后10 和20 d 加强2 次，第一次接种后30 d 血清IgG 上升，脾细胞的CTL 活性明显增加，FACS检测表明脾CD4+和CD8+T 细胞显著增多。Zhang等[32]采用肌肉注射途径将5×107PFU 疫苗接种豚鼠，第一次接种后10 和20 d 加强2 次，第一次接种后40 d 血清IgG 和中和抗体上升，脾细胞增殖明显，脾细胞的CTL 活性显著增加，此时采用皮下注射方法用250 ID50口蹄疫病毒O1NYO 株进行攻击，攻击后1 周检查足垫损伤情况，免疫组和对照组的保护力分别为75%（3/4）和0（0/4）。

将细胞因子的基因与病原体的抗原编码基因共同插入同一载体可提高核酸疫苗的免疫应答[33]。Ma 等[34]将pMD18-P12A-IL-18 与pUTAL-3C 重组得pUTA-3C-P12A-IL-18，加FPV 的282E4株转化CEF，Western 印迹提示重组病毒表达的80 kD 的P1 蛋白可被患者的血清所结合。采用肌肉注射途径将1×107PFU 疫苗接种仔猪，第一次接种后21 d 加强1 次，第一次接种后28 d PBMC 中IFN-γ+SFCs 显著增多，血清IgG 和中和抗体上升，第一次接种后31 d 经皮下注射用103ID50口蹄疫病毒O 株攻击，攻击后14 d 检测足垫皮损情况，免疫组和对照组的保护力分别为80%（4/5）和0（0/5）。

猪园环病毒Ⅱ型的ORF2 编码的衣壳蛋白（Cap）可刺激宿主产生中和抗体[35]。秦晓冰等[36-37]将pKS-P1 与pUTA2 重组得pUTA-P1，与pMDORF2 重组得pUTA-P1-ORF2，加FPV 的282E4 株转化CEF；从重组病毒中抽提总RNA 作为模板，用RT-PCR 方法可克隆出700 bp 的猪圆环病毒ORF2 基因和610 bp 的口蹄疫病毒VP1 基因，Western 印迹提示重组病毒表达的80 kD 的Cap-VP1 蛋白可被患者的血清所结合。采用肌肉注射途径将1×107PFU 疫苗接种BALB/c 鼠，第一次接种后20 和40 d 加强2 次，第一次接种后50 d 血清IgG 上升，脾CD4+和CD8+T 细胞显著增多。

4.2 猪瘟病毒

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的囊膜蛋白E0 是病毒吸附进入宿主细胞的主要蛋白，可诱导宿主产生中和抗体[38]。王养会等[39]以pMD18-E0 为模板扩增E0 基因，插入pSY 得pSY-E0，加FPV 的282E4 株转化CEF；从重组病毒中抽提基因组DNA 作为模板，用PCR 方法可克隆出0.7 kb 的E0 基因。首先，他采用肌肉注射途径将1×106PFU 疫苗接种BALB/c 鼠，第一次接种后1 和2 周加强2 次，血清IgG 在第一次接种后1～4周上升，第一次接种后4 周有明显提升，滴度为1:4096。其次，他经肌肉注射途径将1×108PFU 疫苗接种2 月龄仔猪，第一次接种后1 和2 周加强2次，第一次接种后4 周经肌肉注射用1×108PFU的CSFV 石门株攻击，攻击后10 d 计数发病例数，免疫组和对照组的保护力分别为75%（6/8）和0（0/6）。

4.3 传染性法氏囊病病毒

传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）的VP2 蛋白可诱导小鸡产生中和抗体[40]。Bayliss 等[41]将VP2 基因插入pBR322 得pBR322-VP2，与pEFL18 重组得pEFL18-VP2，再与pFPV9 重组得pFPV-VP2，加FPV 的FP9 株转化CEF，Western 印迹提示重组病毒表达的172 kD 的VP2 蛋白可被患者的血清所结合。采用翅下刺种途径将1×107PFU 疫苗接种7 d 龄仔鸡，第一次接种后2 周加强1 次，第一次接种后4 周经滴鼻用1×108PFU 传染性法氏囊病病毒52/70 株攻击，攻击后3 周免疫组和对照组的存活率分别为100%（23/23）和24%（4/17）。

Heine 等[42]以IBDV 基因组的DNA 为模板扩增VP2 基因，插入pAF09 得pAF09-VP2，加FPV 的野生株转化CEF，免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋白分子。采用翅下刺种途径将2.5×106PFU 疫苗接种4 周龄仔鸡，接种后3 周血清IgG 上升，此时经点眼用100 CID50传染性法氏囊病病毒002-73 株攻击，攻击后2 周免疫组和对照组的存活率分别为100%（10/10）和0（0/10）。Butter 等[43]采用翅下刺种途径将107PFU 疫苗接种7 d 龄仔鸡，第一次接种后2 周加强1 次，血清IgG 和IgM于第一次接种后7～18 d 上升，分别于第一次接种后18 和7 d 有明显提升，第一次接种后25 d 经滴鼻途径用10 EID50传染性法氏囊病病毒F52/70 株攻击，攻击后5 d 免疫组和对照组的保护力分别为78%（23/30）和0（0/30）。

5 重组鸡痘病毒抗逆转录病毒

5.1 Ⅰ型人类免疫缺陷病毒

Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）的env 基因编码前体蛋白gp160，gp160 可裂解为gp120 和gp41。gp120 既可与中和抗体和CTL 结合，又可介导HIV 和易感细胞表面受体的结合。金宁一等[44]以pJenvl-10为模板扩增env 基因，插入pUTA-2 得pUTA-env，加FPV 的282E4 株转染CEF 细胞，用40 mg/mL的5-溴-2-脱氧尿苷（BudR）筛选重组病毒，Western 印迹提示重组病毒表达的120 kD 的gp120 蛋白可被患者的血清所结合，但未报道保护力试验结果

5.2 猴免疫缺陷病毒

猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）与HIV 的核苷酸序列类似，对CD4+T 细胞和巨噬细胞均具有亲嗜性。朱羿龙等[45]以pVR-SIVenv 为模板扩增2160 bp 的env 基因，插入pTKET 得pTKET-env，加FPV 的282E4 转化CEF，Western 印迹检测发现重组病毒表达的120 kD 的gp120 蛋白可被患者的血清所结合，但未进行保护力试验。

6 重组鸡痘病毒抗其他病毒

6.1 禽流感病毒

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是病毒表面的主要蛋白，其中HA 可吸附于宿主细胞表面的唾液酸受体，促进病毒感染细胞；NA 裂解细胞表面的神经氨酸酶残基，在禽流感病毒的扩散、病毒粒子的释放及防止病毒聚集等方面起作用。将HA和NA 的核酸疫苗免疫宿主可诱导中和性抗体的产生[46]。程素娟等[47]以禽流感病毒的总RNA 为模板扩增HA 和NA 基因，插入pGEM-T 得pGEMHA/NA，将pGEM-HA 与p11S 重组得p11S-HA，将pGEM-NA 与pSKCFN 重组得pSK-NA，将pSK-NA与p11S-HA 重组得p11S-HA-NA，加FPV 的282E4株转化CEF，筛选重组病毒，免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋白分子。经皮下注射途径将105PFU 疫苗接种7 d 龄仔鸡，接种后21 d 经肌肉注射途径用105ELD50禽流感病毒H5N5 株攻击，攻击后7 d 免疫组和对照组的存活率分别为100%（10/10）和0（0/10）。

6.2 人乳头瘤病毒16 型

人乳头瘤病毒16 型（Human papillomavirus type 16，HPV-16）的E6/E7 蛋白具有较好的免疫原性。Pozzi 等[48]以pSP65 为模板扩增E6/E7 基因，插入pFP128 得pFP128-E6/E7，加FPV 减毒株转化CEF；从重组病毒中抽提总RNA 作为模板，用RTPCR 方法可克隆出477 bp 的E6 和297 bp 的E7基因。Radaelli 等[49]将1.8×107宫颈癌细胞VX2T 皮下注射新西兰大白兔，同时皮下注射1.8×108PFU重组病毒进行免疫治疗，第一次免疫治疗后1、2、3、4 和5 个月加强5 次，末次治疗后24 d 显示肿瘤消退。Radaelli 等[50]以pCD-E7GGG 为模板扩增298 bp 的E7GGG 基因，插入pFP-MCS-GFP 得pFP-E7GGG，加FPV 的野生株转化CEF，Western印迹检测发现重组病毒表达的18 kD 的E7GGG蛋白可被患者的血清所结合。采用皮下注射途径将5×103宫颈癌TC-1 细胞注射C57BL/6 鼠，注射后3 d 经肌肉注射途径用100 μg pCD-E7GGG进行免疫治疗，第一次免疫治疗后10 d 皮下注射107PFU 重组FPV-E7GGG 疫苗进行第2 次治疗，第一次治疗后23 d 免疫组和对照组的肿瘤检出率分别为16.7%（1/6）和40%（2/5），第一次治疗后45 d 免疫组和对照组的肿瘤检出率分别为50%（3/6）和83.3%（5/6）。Zanotto 等[51-52]以pUF31L1 为模板扩增530 bp 的L1 基因，插入pCR-Ⅱ得pCRⅡ-L1，与pFRMCS-GFP 重组得pFP-L1，加FPV 的野生株转化CEF，Western 印迹检测发现重组病毒表达的55 kD 的L1 蛋白可被患者的血清所结合。采用皮下注射途径将1×107PFU 疫苗接种BALB/c 鼠，第一次接种后2 周加强1 次，血清IgG在接种后15～24 d 上升，第一次接种后24 d 有明显提升，但血清的中和抗体升高不显著。

6.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的ORF5 和ORF3 基因分别编码GP5 和GP3 蛋白，GP5 诱导宿主产生中和抗体，GP3 诱导细胞免疫，且和GP5 具有协同免疫作用。ORF6 基因编码的膜基质蛋白（M）保守性较高，ORF7 基因编码的核衣壳蛋白（N）诱导机体产生抗体的时间较早，且持续时间长。将它们的重组蛋白或DNA 疫苗免疫猪或小鼠均可有效对抗PRRSV 的攻击[53-56]。沈国顺等[57-58]以pMD18-ORF5/ORF3 为模板扩增444 bp 的ORF5 和339 bp 的ORF3 基因，插入pKS（-）得pKS-ORF5/ORF3，将ORF3 基因插入pKSORF5 得pKS-ORF5-ORF3，与pUTAL-IL-18 重组得pUTAL-IL-18-ORF5-ORF3，加FPV 的282E4 株转化CEF，Western 印迹检测发现重组病毒表达的51.8 kD 的融合蛋白和18 kD 的IL-18 可被患者的血清所结合。采用肌肉注射途径将1×107PFU疫苗接种3 周龄仔鸡，第一次接种后3 周加强1次，第一次接种后8 周血清IgG 和中和抗体上升，PBMC 显著增殖，FACS 检测证实PMBC 中CD4+和CD8+T 细胞增多，ELISPOT 表明PBMC 中IFN-γ+SFCs 增多。第一次接种后60 d 经滴鼻方法用105TCID50猪繁殖与呼吸综合征病毒长春株攻击，攻击后7 d 取肺组织检查病毒负荷，免疫组肺组织的病毒负荷下降至1/10 左右。

智海东等[59]以PRRSV 的DNA 为模板扩增380 bp 的N 基因，插入pSY538 得pSY538-N，与pSY681 重组得pSY681-N，加FPV 的282E4 株转化CEF，用40 mg/mL BudR 筛选重组病毒，免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋白分子。韩松等[60]将pBSK-ORF5-ORF6 与pUTA2 重组得pUTA2-ORF5-ORF6，加FPV 的282E4 株转化CEF；从重组病毒中抽提总RNA 作为模板，用RT-PCR 方法可克隆出410 bp 的ORF5 和353 bp 的ORF6 基因。采用肌肉注射途径将1×108PFU 疫苗接种BALB/c鼠，第一次接种后2 和4 周加强2 次，第一次接种后6 周血清IgG 上升，脾细胞显著增殖，可分泌高水平的IFN-γ，但不分泌IL-4 和IL-10 等。

6.4 传染性支气管炎病毒

传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）的棘突蛋白1（S1）是一种保护性免疫原[61]。管倩等[62]以pGEM-S1 为模板扩增S1 基因，插入pSY538 得pSY538-S1，与pSY681 重组得pSY681-S1，将IL-18 基因插入得pSY681-S1-IL-18，加FPV 的017 株转化CEF；从重组病毒中抽提总RNA 作为模板，用RT-PCR 方法可克隆出1.74 kb的S1 基因和0.6 kb 的IL-18 基因。Chen 等[63]采用翅下刺种途径将106PFU 重组病毒接种7 d 龄莱杭仔鸡，接种后6 周血清IgG 上升，FACS 检测表明PBMC 中CD4+和CD8+T 细胞增加，此时经点眼滴鼻途径用100 EID50传染性支气管炎病毒HN99 株攻击，攻击后10 d 取肾组织检查病毒负荷，免疫组和对照组的保护力分别为100%（20/20）和0（0/20）。Shi 等[64]采用类似方法构建了rFPV-S1-IFN-γ，经翅下刺种途径将103PFU 疫苗接种4 周龄仔鸡，接种后3 周血清IgG 上升，FACS 检测显示PBMC 中CD4+T 细胞增加，此时经滴鼻用104EID50传染性支气管炎病毒LX4 株攻击，攻击后6 d 取咽拭子检查病毒负荷，免疫组和对照组的保护力分别为60%（3/5）和0（0/5）。

6.5 牛痘病毒

牛痘病毒（Vaccinia virus，VV）的LI、A27、A33和B5 蛋白是4 种主要的病毒粒子蛋白，主要参与病毒的吸附、融合和穿钻靶细胞，可诱导宿主产生较好的保护力[65]。Pacchioni 等[66]以牛痘病毒RR株的总RNA 为模板分别扩增L1R、A27L、A33R 和B5R 基因，插入pBS Ⅱ得pBS-L1R/A27L/A33R/B5R，与pFPmcs 重组得pFP-L1R/A27L/A33R/B5R，加FPV 的野生株转化CEF，Western 印迹检测发现重组病毒表达的27 kD 的L1R、12.7 kD 的A27L、21 kD 的A33R 和37 kD 的B5R 蛋白可被患者的血清所结合。

6.6 出血性肠炎病毒

出血性肠炎病毒（Hemorrhagic enteritis virus，HEV）是火鸡出血性肠炎的常见病原体。六邻体蛋白（hexon）是壳蛋白的主要结构成分，是有效的免疫原[67]。Cardona 等[68-69]以HEV 基因组DNA 为模板扩增hexon 基因，插入pFPV 得pFPV-hexon，加FPV 的野生株转化CEF，Western 印迹检测发现重组病毒表达的100 kD 的hexon 蛋白可被患者的血清所结合。采用翅下接种途径将105PFU 疫苗接种1 d 龄仔鸡，接种后4 周血清IgG 上升，接种后6 周口服106TCID50出血性肠炎病毒有毒株进行攻击，攻击后6 d 免疫组和对照组的保护力分别为100%（7/7）和0（0/7）。

6.7 狂犬病毒

狂犬病毒（Rabies virus，RV）的狂犬病毒糖蛋白（RGP）具有较强的免疫原性[70]。金宁一等[71-72]将pSK-RVG 与pUTA2 重组得pUTA2-RVG，加FPV 的282E4 株转化CEF，Western 印迹检测发现重组病毒表达的67 kD 的蛋白可被患者的血清所结合。采用皮下注射途径将1×107PFU 疫苗接种昆明鼠，第一次接种后2 周经肌肉注射用100 μg的pVAX-RVG 加强，第一次接种后4 周血清IgG上升，脾CD4+和CD8+T 细胞明显增加，此时经肌肉注射途径用10M LD50狂犬病毒CVS 株攻击，攻击后43 d 免疫组和对照组的保护力分别为42%（3/7）和0（3/7）。

6.8 猪园环病毒Ⅱ型

猪园环病毒Ⅱ型（Porcine circovirus type 2，PCV2）的基因组有2 个ORF，其中ORF1 编码复制相关蛋白（Rep），ORF2 编码衣壳蛋白（Cap），自身可聚合为病毒样颗粒。Rep 和Cap 可诱导仔猪产生中和抗体[73]。韩松等[74]将pMD18-ORF2/PCV 与pUTA2 重组得pUTA2-ORF2，加FPV 的282E4 株共同转化CEF，从重组病毒中抽提总RNA 作为模板，用RT-PCR 方法可克隆出260 bp 的ORF2 基因。郭晓庆等[75]以PCV2 的DNA 为模板扩增ORF2基因，插入pSY681 得pSY681-ORF2，将IL-18 基因插入得pSY681-ORF2-IL-18，加FPV 的282E4 株转化CEF，从重组病毒中抽提总RNA 作为模板，用RT-PCR 方法可克隆出702 bp 的ORF2 和579 bp 的IL-18 基因。

6.9 番鸭细小病毒

番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）是番鸭细小病毒病的病原体，主要引起急性败血性传染病，致死率高。VP3 蛋白是一种主要结构蛋白，具有较强的免疫原性[76]。李林林等[77]将pMD-VP3 与pTKS 重组得pTKS-VP3，与pCDEGFP 重组得pTKS-VP3-EGFP，加FPV 的282E4 株转化CEF，从重组病毒中抽提基因组DNA 作为模板，用PCR 方法可克隆出1.6 kb 的VP3 基因，免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋白分子。

7 重组鸡痘病毒抗细菌

7.1 禽艾美球虫

禽艾美球虫（Eimeria tenella）是鸡球虫病的病原体，主要引起肠道病变。Rhomboid 基因编码蛋白在表皮生长因子受体的信号传导中发挥作用[78]。杨桂连等[79-80]以禽艾美球虫卵囊的总RNA为模板扩增774 bp 的Rhomboid 基因，插入pMD18-T 得pMD18-Rhomboid，与pUYA2 重组得pUTA2-Rhomboid，加FPV 的282E4 株转化CEF，Western 印迹检测发现重组病毒表达的28 kD 的蛋白可被患者的血清所结合。采用皮下注射途径将102、103和104PFU 疫苗分别接种7 d 龄仔鸡，第一次接种后7 d 加强1 次，第一次接种后14 d PBMC 中CD4+和CD8+T 细胞增加，此时经口服途径用5×104禽艾美球虫的卵囊攻击，攻击后7 d 计数粪便卵囊，发现102、103和104PFU 疫苗免疫组的减囊率分别为67.5% 、71.1% 和71.2%。接着采用翅下刺种途径将102、104和106PFU 疫苗接种1 d 龄仔鸡，接种后2 周血清IgG 上升，PBMC 显著增殖，此时经腹腔注射途径用5×104禽艾美球虫卵囊攻击，攻击后8 d 计数粪便卵囊，各组的减囊率分别为39.6%、41.1%和41.7%。

7.2 鸡败血支原体

鸡败血支原体（Mycoplasma gallisepticum）引起的鸡支原体病主要以慢性呼吸道感染为特征[81]。Zhang 等[81]采用翅下刺种途径将106PFU 的rFPV-mgc 疫苗接种8 周龄仔鸡，接种后2 周经皮下注射途径用103EID50有毒株攻击，攻击后2 周计数发病情况，免疫组和对照组的保护力分别为90%（9/10）和0（0/10）。

8 重组鸡痘病毒抗寄生虫

8.1 恶性疟原虫

恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，Pf）的肝期抗原3（LSA-3）、子孢子苏氨酸和天冬酰胺富集蛋白（STARP）、外排蛋白1（Exp1）、Pfs16、血小板相关黏附蛋白（TRAP）和肝期抗原1（LSA-1）均是较好的疟疾疫苗的候选抗原，将它们加各种佐剂免疫夜猴、猩猩或健康志愿者均可诱导有效的免疫应答，并可对抗恶性疟原虫子孢子的攻击感染[83-85]。L3SEPTL 基因含这6 种抗原的细胞表位，Prieur 等[86]人工合成L3SEPTL 基因，将其插入pFP-GFP 得pFP-L3SEPTL，加FPV 的FP9 株转化CEF，免疫荧光提示重组病毒可以呈现融合蛋白分子。采用静脉注射途径将106PFU 疫苗接种C57BL/6 鼠，第一次接种后2 周加强1 次，第一次接种后4 周PBMC 的IFN-γ+SFCs 增加，脾细胞增殖，脾细胞CTL 反应性增强。

8.2 伯氏疟原虫

伯氏疟原虫（Plasmodium berghei，Pb）的环子孢子蛋白（CSP）在子孢子入侵肝细胞时起重要作用，将PbCSP 合成肽加P1005 佐剂皮下接种A/J 鼠可有效对抗Pb 子孢子的攻击[87]。Anderson 等[88]将PbCSP 基因插入pEFL29 得pEFL29-PbCSP，加FPV的FP9 株转化CEF，Western 印迹检测发现重组病毒表达的44 kD 的PbCSP 蛋白可被患者的血清所结合。采用静脉注射途径将1×106PFU 疫苗接种BALB/c 鼠，第一次接种后2 周静脉注射1×106PFU 重组牛痘病毒（MVA-PbCSP）进行加强，第一次接种后4 周脾IFN-γ+SFCs 增加，FACS 检测显示脾CD8+T 细胞增加，第一次接种后6 周经静脉注射途径用500 个伯氏疟原虫Anka 株子孢子攻击，攻击后2 周取血镜检Pb，免疫组和对照组的保护力分别为67.5%（27/40）和0（0/10）。

9 结语

重组鸡痘病毒具有下述优点：鸡痘病毒有严格的宿主特异性，只感染禽类，在哺乳动物的细胞内只产生流产性感染；重组鸡痘病毒不容易发生散毒现象，对人和其他哺乳动物无危险性；重组鸡痘病毒能有效进入一些哺乳动物的细胞内并进行早期基因、少量晚期基因的表达和病毒DNA 复制，但不能发育为成熟的病毒粒子，然而这种一过性感染并不影响外源基因的正确表达；重组鸡痘病毒具有自身的酶系统和调控信号，其转录、翻译和调控均在胞浆进行，避免了病毒基因组插入宿主细胞染色体的可能性；重组鸡痘病毒表达的蛋白存在糖基化和磷酸化等加工修饰过程，与天然蛋白的差异不大；重组鸡痘病毒可诱导机体产生细胞、体液和黏膜免疫应答，免疫应答的持续时间长；重组鸡痘病毒的病毒衣壳蛋白可直接激活核因子NF-κB，在短期即可激发有效的免疫应答；重组鸡痘病毒较稳定，反复冻融并不引起病毒的改变和失活。

重组鸡痘病毒存在下述不足：非复制型机理的研究尚不深入；表达载体缺乏高效启动子或增强子，导致表达效率较低；载体抗原和靶抗原存在竞争；母源抗体的干扰可影响免疫效果。

随着现代生物技术的发展，人们将对病毒、细菌或寄生虫的基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学及表观遗传学进行深入研究，从而弄清病原蛋白的抗原结构与功能的关系，筛选新的抗原分子，构建由各期抗原分子组成的多期多价疫苗。在重组鸡痘病毒的构建过程中，要深入了解各个启动子的特性，弄清启动子和起始密码子的距离以及启动子之间相互作用是否影响外源基因的表达效率；选用不同的启动子构建载体能否提高重组鸡痘病毒的遗传稳定性；不同启动子的反向串联能否减少外源基因在转录水平上的干扰，促进外源基因的表达；重组鸡痘病毒共表达细胞因子的探索；重组鸡痘病毒共表达多种病原蛋白的探索；新型佐剂和疫苗载体的研制等。相信随着这些问题的阐明，必将推动重组鸡痘病毒疫苗的研究跃上一个新的台阶。