比较碱性彗星试验与γ-H2AX法评价甲醛诱导的DNA交联

文海若，任璐，王瑜，姜华，李艳秋，耿兴超，李波，黄芝瑛，王雪



比较碱性彗星试验与γ-H2AX法评价甲醛诱导的DNA交联

文海若*，任璐*，王瑜，姜华，李艳秋，耿兴超，李波，黄芝瑛，王雪

100176 北京，中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心/药物非临床安全评价研究北京市重点实验室（文海若、任璐、姜华、耿兴超、李波、王雪）；510006 广州，中山大学药学院（任璐、黄芝瑛）；100015 北京，珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司（王瑜、李艳秋）

DNA 交联是环境诱变剂和化学致癌物诱发的遗传物质损伤之一，主要包括 DNA-蛋白质交联（DNA-protein crosslink，DPC）和 DNA-DNA 交联（DNA-DNA crosslink，DDC）两类[1]。DNA 交联的形成可导致 DNA 复制过程中重要基因的丢失，从而造成染色体缺失、重排、转位、倒置等染色体结构和数目的畸变，对子代细胞的遗传物质产生影响，严重时可导致肿瘤或子代畸形[2]。DNA 交联与断裂相比难于修复或易于形成错误修复，且在细胞周期中可维持较长一段时间。故世界卫生组织（WHO）提出 DNA 交联可作为 DNA 损伤的生物标志物，用于对化合物或环境因素的潜在遗传毒性进行筛查[3]。常见的可导致 DNA 交联的药物或因素包括甲醛、顺铂、环磷酰胺、丝裂霉素、油烟、氧化型染发剂、电离辐射等。

使用小牛胸腺 DNA 开展的溴化乙锭荧光分析法（ethidium bromide fluorescence assay，EFA）是经典的检测 DNA 交联的方法之一，该方法利用溴化乙锭嵌入双链 DNA（而非单链 DNA）后荧光强度可明显升高，以及热变性后交联的 DNA 无法解链从而维持高荧光强度的原理，对化合物的潜在 DNA 交联作用进行检测[4]。因溴化乙锭荧光分析法应用 96 孔细胞培养板和荧光酶标仪进行检测，快速而简便，是常用的 DNA 交联水平检测方法。近年来，随着同时检测 DNA 单链和双链断裂的碱性彗星电泳试验（又称碱性单细胞凝胶细胞电泳，电泳条件 pH > 13）技术在遗传毒性评价领域的普及，也逐渐兴起通过在彗星电泳中额外添加断裂剂[5-7]，如过氧化氢（H2O2）或蛋白酶 K，来检测受试物的 DNA 交联效应。此外，以聚集于 DNA 双链断裂位点的磷酸化的 H2AX 组蛋白（γ-H2AX）作为生物标志物的 γ-H2AX 试验也是一种新兴的用来评价 DNA 双链断裂水平的试验方法[8]。与传统的溴化乙锭荧光法相比，彗星电泳和 γ-H2AX 试验均在细胞培养条件下加样处理，可以更好地模拟检测样本与生物体的作用方式，亦不涉及致癌物溴化乙锭的使用。

本研究分别使用溴化乙锭法、彗星电泳法和 γ-H2AX 法比较甲醛（formaldehyde）所致交联的检测效果，其中 H2O2作为 DNA 断裂阳性剂，为 DNA 交联检测方法的优化及推广提供借鉴。其中以荧光染色并使用高内涵法分析 γ-H2AX 灶点来评价 DNA 交联在此前未见文献报道。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

BX40 型正置光学显微镜购自日本 Olympus 公司；DYCP-31F 型电泳仪和DYY-6C 电泳仪购自北京市六一仪器厂；NTS-1300 恒温振荡水槽购自东京理化器械株式会社；Komet 6.0 图像分析系统购自英国安道尔科技有限公司；Eclipse 80i 荧光显微镜购自日本尼康公司；Synergy HT 荧光酶标仪购自美国 BioTek 公司；Operetta 高内涵成像系统购自英国珀金埃尔默公司。

溶媒对照（ddH2O）使用本中心 MilliQ-A10 超纯水机生产的超纯水，121 ℃、15 min 高压灭菌，4 ℃冰箱保存；DNA 断裂阳性剂 H2O2和 DNA 交联阳性剂甲醛购自国药集团化学试剂北京有限公司；RPMI 1640 培养基、1% 青链霉素混合液、0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和胎牛血清均购自美国 Gibco 公司；溴化乙锭购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，用 ddH2O 配成 1 μg/ml 溶液，避光保存；小牛胸腺 DNA 购自北京索莱宝科技有限公司，用 Tris-EDTA 缓冲液（10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA）配成 1 mg/ml 和 3 mg/ml 溶液，4 ℃保存；perm/wash buffer（554723）和 Alexa Fluor®647 Mouse anti-H2AX（pS139）（560447）购自碧迪医疗器械（上海）有限公司；Comet Assay®Kit 彗星检测试剂盒购自美国 Trevigen 公司；Hoechst 33342 购自美国 Invitrogen 公司。

中国仓鼠肺细胞 CHL（第 4 ~ 6 代）来自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，液氮保存。

1.2 方法

1.2.1 溴化乙锭法 准备 1.5 ml EP 管，每管加入 10 μl 浓度为 1 mg/ml 或 3 mg/ml 的小牛胸腺 DNA 溶液，再加入不同浓度（10、50、100、300、500 和 1000 μmol/L）的甲醛溶液，充分混匀后放入 37 ℃恒温水浴锅中水浴30 min。试验平行设置未添加甲醛的空白对照组，每组做6 个复孔。

水浴后向每管加入 1 ml 溴化乙锭溶液，混匀后测定其相对荧光强度。之后将反应样品放入 100 ℃条件下加热 8 min，在室温下迅速冷却 10 min，再次测定各自的相对荧光强度。通过公式 Ct（%）=（ft– fn）/（1 – fn）× 100% 计算出 DNA 交联率，其中 ft为经受试物处理管的相对荧光强度，fn为未经受试物处理管的相对荧光强度。

1.2.2 碱性彗星试验 CHL 细胞使用 RPMI 1640 培养基（含 10% 胎牛血清与 1% 青链霉素混合液）在 37 ℃、5% CO2条件下培养，每 3 天传代一次，传代时细胞按 2 × 105个/ml 密度接种。

待细胞生长良好并达到对数生长期后，取细胞悬液离心，去除含血清的培养基，并用不含血清的培养基重悬，将细胞密度调至 1.0 × 105个/ml，每管 3 ml 分装到离心管。每管添加 30 μl 甲醛，使其终浓度为 0、100、300、500 和 1000 μmol/L，每浓度重复 3 管，于 37 ℃水浴中与甲醛孵育 1.5 h。受试物处理完毕后，分别加入终浓度为 0、100、200 μmol/L 的 DNA 断裂剂 H2O2，于 37 ℃水浴中作用 15 min。处理结束后，离心并收获细胞，将细胞重悬于 1 ml PBS，调整细胞密度为 3 × 105个/ml 用于彗星电泳。

彗星试验使用 Trevigen Comet Assay®Kit 彗星检测试剂盒，操作步骤如下。标记 1.5 ml 试管，37 ℃水浴，将300 μl 凝胶与 30 μl 细胞悬液混合均匀后铺片，每孔 50 μl，每个样本平行 2 孔。铺片结束后迅速将玻片置于4 ℃避光冷却，并置于 4 ℃预冷的裂解液中避光过夜。裂解后使用预冷的超纯水清洗 3 次。将玻片平行码放在电泳槽内，缓缓添加预冷的碱性解旋液（pH > 13）。室温、避光解旋 20 min。电泳时设置电压为 0.7 V/cm，此时电流约为 300 mA，电泳约 20 min。电泳结束后，玻片在中和液中漂洗 10 min之后取出，浸于无水乙醇溶液不少于 10 min。标本于室温下干燥保存[9]。

染色时将稀释过的 SYBR Green I（1:10000）加在每孔表面，4 ℃冰箱放置 5 min，轻轻去除多余液体，室温、避光晾干。拍照时选择靠近孔中间位置且细胞密度适中的视野拍照，尽量避免细胞重叠。使用 Komet 6.0 彗星图像分析软件进行分析，每孔计数 100 个细胞，分析尾 DNA 含量百分率和 Olive 尾距的中位数。

1.2.3 γ-H2AX 法 CHL细胞培养方法同 1.2.2，待细胞生长良好并达到对数生长期后，以 1 × 104个/孔的密度接种于 96 孔板。细胞接种 24 h 后，给予终浓度为 0、200、300、500 和 1000 μmol/L 的甲醛，于 37 ℃条件下培养 1.5 h。染毒完毕后，分别加入终浓度为 0、100、200 μmol/L 的 H2O2，于 37 ℃水浴中作用 15 min。给药结束后更换无血清培养基，并使细胞在 37 ℃条件下继续培养 1 h。每条件复孔 8 ~ 10 个。

细胞恢复结束后，吸出培养基，用 PBS 洗涤 2 次。用 3.7% 甲醛室温固定 10 min，之后再用 PBS 洗涤2 次。每孔加入 100 μl 1 × perm/wash buffer 通透 15 min，用 1 × perm/wash buffer 洗两次。加入 100 μl 3% FBS（1 × perm/wash buffer 稀释）封闭 15 ~ 30 min，加入用 1 × perm/wash buffer 稀释的 γ-H2AX 抗体（1:100），30 min、4 ℃避光孵育。吸去抗体，用 1 × perm/wash buffer 洗3 次，每孔加入 100 μl 含Hoechst 33342（终浓度 5 μg/ml，1 × perm/wash buffer 稀释）的溶液，37 ℃、5% CO2条件下避光染色 10 min。用 1 × perm/wash buffer 洗两次，最后一次保留液体。样本 4 ℃避光保存，并使用 Operetta 高内涵分析仪进行拍照与数据分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 溴化乙锭法检测甲醛导致的 DNA 交联作用

分别使用浓度范围在 10 ~ 1000 μmol/L 之间的甲醛溶液与浓度为 1 mg/ml 或 3 mg/ml 小牛胸腺 DNA 相互作用，试验结果如图 1 所示。随着甲醛浓度的增加，不同浓度的小牛胸腺 DNA 双链交联率均存在浓度-效应相关性。小牛胸腺 DNA 浓度为 3 mg/ml 时，其检测效果更为灵敏。甲醛浓度为 50 μmol/L 起，其 DNA 交联率的升高水平（10.35% ± 7.01%）开始与相同小牛胸腺 DNA 浓度条件下的对照组比较存在显著差异（< 0.05，< 0.01，< 0.001），甲醛浓度为 300 μmol/L 起，小牛胸腺 DNA 3 mg/ml 组与 1 mg/ml 相比存在显著性差异（< 0.01）。小牛胸腺 DNA3 mg/ml 组，当甲醛浓度为 500 μmol/L 时 DNA 双链交联率最高（88.67% ± 10.04%），当甲醛浓度增加至 1000 μmol/L 时 DNA 双链交联率反而有所下降（50.81% ± 7.08%），可能与此浓度下凋亡细胞较多有关。

图 1 甲醛导致小牛胸腺DNA 交联率改变（与相同浓度小牛胸腺DNA 对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与相同甲醛浓度组比较，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001）

2.2 碱性彗星电泳检测甲醛导致的 DNA 交联作用

用于检测单链和双链 DNA 损伤的碱性彗星试验主要通过定量分析细胞核的“彗星”样拖尾程度对其 DNA 损伤水平进行评估。常见的分析指标包括尾 DNA 含量百分率、Olive 尾矩（OTM）、尾长、尾面积等。其中尾 DNA 含量百分率和OTM 两项指标的灵敏度好，是最常用的评价指标[9]。在试验体系中额外添加 DNA 断裂剂 H2O2后，细胞应出现不同程度的 DNA 断裂，即表现为尾 DNA 含量百分率和OTM 的显著升高。本研究结果（图 2）提示，甲醛浓度在 300 μmol/L 及以下时，主要表现为 DNA 断裂作用，而当浓度增加至 500 μmol/L 及以上时，与对照组比较未见明显 DNA 拖尾。随着 H2O2浓度升高与尾 DNA 含量百分率和 OTM 数值升高存在一定浓度效应关系，H2O2浓度为 200 μmol/L 时诱导的尾DNA 含量百分率和 OTM 数值分别为 17.31% ± 1.25% 和3.56 ± 0.84（未经 H2O2和甲醛处理组则为 4.50% ± 0.10% 和 0.29 ± 0.05）。在给予不同浓度甲醛作用后，H2O2诱导的 DNA 断裂效应存在显著性降低，如 300 μmol/L 甲醛可将 100 μmol/L 和 200 μmol/L H2O2诱导的细胞尾 DNA 含量百分率分别由 12.46% ± 1.22% 和 17.31% ± 1.25% 降低至 4.26% ± 0.41% 和 5.25% ± 0.63%（< 0.001）。可见彗星试验可有效检出甲醛诱导的 DNA 交联。

2.3 γ-H2AX 法检测甲醛导致的 DNA 交联作用

DNA 双链断裂发生后，断裂位点附近的磷酸化 H2AX 组蛋白（即 γ-H2AX）可迅速聚集于断裂部位形成 γ-H2AX 灶点，从而放大 DNA 损伤信号并募集 DNA 修复因子对该损伤位点进行修复[10]。γ-H2AX 法利用这一 DNA 损伤修复原理，通过标定相应免疫荧光抗体识别 γ-H2AX，并分析细胞中灶点形成率，可对受试物诱导的 DNA 损伤严重程度进行评估。本研究在此基础上，使用 H2O2构建 DNA 断裂细胞模型，并添加不同浓度的甲醛以评价其潜在 DNA 双链交联效应。结果（图 3）发现，甲醛浓度在 300 μmol/L 及以下时可导致 γ-H2AX 灶点形成率与未经处理组比较显著升高（< 0.001），浓度增至 500 μmol/L 及以上时，γ-H2AX 灶点形成率则有所降低。且 100 和 200 μmol/L H2O2均可诱导灶点率的显著性升高（< 0.01）。在给予不同浓度甲醛作用后，H2O2诱导的 DNA 双链断裂效应显著性降低，如 500 μmol/L 甲醛可将 100 μmol/L 和 200 μmol/L H2O2诱导的平均γ-H2AX 灶点形成率分别由（17.44 ± 1.50）个/细胞和（19.01 ± 2.60）个/细胞降低至（9.40 ±2.32）个/细胞和（9.97 ± 2.13）个/细胞（< 0.05，< 0.01）。上述趋势与彗星试验结果基本相符，以 γ-H2AX 为生物标志物可检出甲醛诱导的 DNA 交联效应，但灵敏度低于彗星试验。

图 2 甲醛对经H2O2处理的CHL 细胞彗星电泳结果的影响（A：彗星电泳结果示意图；B：不同处理条件对尾 DNA 含量百分率的影响；C：不同处理条件对 Olive 尾矩的影响；与0 μmol/L H2O2浓度条件下未经甲醛处理组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与100 μmol/L H2O2浓度条件下未经甲醛处理组比较，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；与200 μmol/L H2O2浓度条件下未经甲醛处理组比较，++P < 0.01，+++P < 0.001；与0 μmol/L H2O2无甲醛处理组比较，△P < 0.001）

图 3 甲醛对经H2O2处理的CHL 细胞核γ-H2AX 灶点率的影响（A：不同浓度甲醛对细胞核中γ-H2AX 灶点数量影响示意图；B：不同处理条件对平均每细胞含γ-H2AX 灶点数的影响；与0 μmol/L H2O2浓度条件下未经甲醛处理组比较，**P < 0.01，***P < 0.001；与100 μmol/L H2O2浓度条件下未经甲醛处理组比较，##P < 0.01，###P < 0.001；与200 μmol/L H2O2浓度条件下未经甲醛处理组比较，+P < 0.05，++P < 0.01；与0 μmol/L H2O2无甲醛处理组比较，△P < 0.001）

3 讨论

DNA 交联可影响 DNA 的正常复制功能，是导致基因突变和肿瘤形成的重要分子基础。甲醛是室内环境污染的“罪魁祸首”之一，被国际癌症研究机构（IARC）列为 A2 类致癌物[11]。既往文献报道甲醛在低浓度条件下（125 μmol/L 以下）可诱导 DNA 断裂，其作用机制为亲电子剂攻击核酸等生物大分子，以及破坏氧自由基生成平衡；而在高浓度条件下（125 μmol/L 以上），甲醛可导致 DNA 交联，包括 DDC 以及 DPC[12]。甲醛可通过诱导还原型谷胱甘肽耗竭导致大量羟自由基和氧自由基在细胞内蓄积，从而促进核酸或蛋白质上的氨基形成不稳定的羟甲基化合物，以及 DPC 的过量形成。DPC 的形成对 DNA 构象与功能产生严重影响，进而影响 DNA 的复制与转录[13]。

本研究对兼顾双链和单链 DNA 断裂与交联作用的碱性彗星试验和针对双链 DNA 交联的 γ-H2AX 试验法对甲醛诱导的 DNA 交联效应的检测效果进行对比。结果发现 500 μmol/L 甲醛可诱导 CHL 细胞 DNA 交联效应达到峰值，上述试验结果与溴化乙锭法基本相符。而 H2O2浓度为 100 ~ 200 μmol/L 时，可在不明显干扰细胞生存率的情况下获得显著的 DNA 断裂效果，使用碱性彗星试验或 γ-H2AX 试验检测 DNA 交联时可参考该浓度范围。在所用细胞和给药条件相同的情况下，碱性彗星试验可检出由 100 μmol/L H2O2诱导的 DNA 断裂和 300 μmol/L 甲醛诱导的 DNA 交联效应，而 γ-H2AX 试验则可检出由100 μmol/L H2O2诱导的 DNA 断裂和 500 μmol/L 甲醛诱导的 DNA 交联，在检测 DNA 断裂与交联方面碱性彗星试验比 γ-H2AX 试验更为灵敏，这与前者检测对象为单链 DNA 断裂有关。

溴化乙锭法是传统的检测 DNA 交联的方法，但试验涉及致癌物溴化乙锭的使用。与之相比，彗星试验和 γ-H2AX 试验的试验系统与受试物的作用方式与真实接触情况更为接近。彗星试验可用于检测单链及双链 DNA 损伤，是一种较为敏感的 DNA 损伤检测手段。该试验利用细胞核完整时电泳后无法在凝胶中产生位移，而受损的 DNA 片段可在电场力的作用下在凝胶中迁移形成彗星状图像的原理，对 DNA 损伤程度进行判断。它具有可提供单个细胞 DNA 损伤信息、不受细胞核型限制、可检出0.1 DNA / 109D 水平的断裂、所需细胞量较少及无需放射性示踪剂等优点[14]。随着 2015 年联合验证工作在国内的开展，彗星试验在国内逐渐普及并列入了 2018 年新颁布的遗传毒性指导原则备选试验方法[15]。然而，彗星试验的操作流程较为繁复，当前市售彗星试验的试剂盒无法兼顾原位培养、制片和电泳的功能，因此无法对其进行真正意义上的高通量检测。尽管如此，本研究结果显示碱性彗星电泳在 DNA 交联检测的灵敏性和可操作性方面具有不可替代的优势。γ-H2AX 位点是经典的用于检测 DNA 双链断裂的生物标志物，γ-H2AX 灶点数与断裂数呈线性对应关系[8, 16]。而双链断裂是最为严重的一类 DNA 损伤，是否可准确而快速地修复双链断裂对维持基因组稳定性而言至关重要。通过免疫荧光技术对 γ-H2AX 进行标记，可在荧光显微镜下或使用流式细胞术对 γ-H2AX 灶点的形成率进行分析，从而了解细胞 DNA 损伤程度[17]。该方法已在国内外应用于化合物潜在 DNA 损伤能力的评价。此外，γ-H2AX 灶点可与其他与遗传毒性、细胞凋亡或增殖有关的生物标志物，如 p53、PARP 和磷酸化组蛋白 H3 检测相结合，对受试物的遗传毒性进行综合评价。Litron 实验室已有市售的相关高通量流式检测试剂盒，并初步完成了实验室间验证[18]。84 种化合物的 231 项测试结果提示该方法的灵敏性、准确性和一致性可达 92%。本研究根据其检测 DNA 断裂的原理，首次尝试使用该方法检测 DNA 交联效应并获得成功。虽然 γ-H2AX 法检测 DNA 交联的灵敏性不及碱性彗星试验，但更易于通过流式或荧光染色结合高内涵扫描分析的方法来实现高通量，可操作性较强，且有助于形成试验方法的标准化。

综上所述，本研究以甲醛为例，验证在额外添加 H2O2的条件下可使用碱性彗星试验和 γ-H2AX 试验对受试物的潜在致 DNA 交联效应进行评价。两种方法在实际应用中优势不同，前者兼顾单链和双链损伤可更为灵敏地检出 DNA 断裂与交联，而后者则更易于与多项生物标志物结合实现高通量遗传毒理学评价。本研究有助于上述方法在 DNA 损伤评价领域的应用及推广，为环境诱变剂、化妆品和药物安全性评价相关领域研究者提供一定借鉴。

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*同为第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.01.018

国家十三五“重大新药创制”科技重大专项（2018ZX 09201017）

王雪，Email：xue_wang@nifdc.org.cn；黄芝瑛，Email：hzhiying@mail.sysu.edu.cn

2018-08-30