超临界流体色谱法在手性药物分离中的应用

仇小丹，赵婷，朱志玲，山广志



超临界流体色谱法在手性药物分离中的应用

仇小丹，赵婷，朱志玲，山广志

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所分析测试中心

手性是指化学分子的实物与其镜像不能重叠的现象，在自然界中普遍存在。在某些情况下，手性化合物中不同异构体的活性、毒性、代谢可能会存在差别，因此需要对异构体进行分离，并对杂质异构体的含量进行限定以保证药品的安全性、有效性。随着对手性异构体在体内活性差异的认知，以及手性药物上市数量的增多，人们对手性分离技术的需求愈发迫切。目前可应用于手性分离的技术有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、毛细管电泳法（CE）等。其中，HPLC，尤其是正相液相色谱（NPLC）技术发展最为成熟，应用最为广泛。近年来，随着对分离速度、分析方法环保性要求的逐渐提升，再加上 HPLC 及 GC 对某些手性物质分离能力较差、分析过程繁琐等，超临界流体色谱法（supercritical fluid chromatography，SFC）在手性分离领域日益受到重视。SFC 是以超临界流体作为流动相，根据待分离化合物在固定相与流动相之间的分配系数不同实现分离，能够在一定程度上弥补 HPLC 及 GC 在手性分离方面存在的不足。

1 超临界流体色谱法的发展历史

SFC 最早在 20 世纪 60 年代由 Klesper 等[1]提出，起初被称为高压或高密度气相色谱法，主要以超临界烃类作为流动相。在 20 世纪 70 年代，二氧化碳成为最常用的超临界流体[2]。

早期的 SFC 体系复杂，并且当温度、压力及组成发生改变时，超临界流体色谱行为更为复杂[3]，因此直到最近十几年SFC才逐渐回归大众视野并迅速发展。得益于固定相及商品化仪器的相继研发成功，SFC 以其鲜明的特征成为分析与制备领域较为常用的分析方法。

2 超临界流体色谱法分离手性药物的关键参数

2.1 流动相

2.1.1 超临界流体 当化合物所处的温度、压力均超过临界值时，物质处于超临界状态（图 1），其黏度接近于气体，密度、溶剂化能力接近于液体，而扩散率处于气态与液态之间[4]。因此与 GC 流动相相比，其溶剂化能力更强；与 HPLC 中常用的流动相相比，超临界流体黏度低，扩散性高，柱压降较低[5-6]。以上特点使得 SFC 可用较大的流速进行快速分析，而不会对色谱峰的峰形产生较大影响，从而大大缩短分析时间[7]。

图 1 化合物相图

现代 SFC 最常用的超临界流体为超临界二氧化碳。较其他物质来说，它的临界状态（Tc= 31.26 ℃，Pc= 7.4 MPa）更易于达到[4]；较低的临界温度有利于分析热不稳定化合物；分析后只要将压力降至大气压之后便可将二氧化碳转化为气态除去，也可重新纯化，循环利用降低成本；二氧化碳化学惰性，对人体及环境毒害小，不易燃，并且其高分子扩散性有利于将分析物向质谱转移[5-6]。

2.1.2 改性剂 二氧化碳极性与戊烷或己烷相近，极性较弱，难以洗脱因含有氢键给体或氢键受体而与极性固定相作用强烈的化合物，因此通常需要加入改性剂增强流动相的溶解和洗脱能力[8]。

在 SFC 中，改性剂可以发挥多种作用。它可以与分析物产生相互作用，增加分析物与流动相的亲和力，使分析物被洗脱；可以与分析物竞争固定相的氢键供体与受体位点[9]；或吸附到固定相表面，使得固定相的化学性质发生改变[8]。此外，改性剂也能够改变手性选择链的空间位置或影响分析物的结构，对分析物与固定相之间复杂的相互作用产生影响，影响立体选择性[5]。

固定相表面的游离硅醇基具有氢键受体及氢键给体的双重性质，容易导致色谱峰拖尾，峰形较差。因此，在 SFC 中经常使用同时具有氢键给体与受体性质的改性剂，如甲醇、乙醇等[8]。此外，溶剂化能力也影响分析物的保留。醇类溶剂质子化能力强于乙腈等非质子溶剂，因此，SFC 中醇类溶剂洗脱能力强于乙腈[8]。在醇类溶剂中，甲醇极性最强，对于化合物的溶解能力最强，同时与乙醇及异丙醇相比，甲醇的表面张力比较低，在质谱中离子化效率高，灵敏度高[10]，因此甲醇成为 SFC 中最为常用的改性剂。乙腈为非质子溶剂，对硅胶表面游离硅醇基残基的覆盖率较低，当乙腈作为共溶剂时，可能会使分析物的色谱峰峰形变差，柱效降低[11]。

在 SFC 手性分析过程中，手性环境除了可通过手性固定相来提供外，也可以通过手性流动相与非手性固定相的组合来实现。向流动相中加入手性选择剂，手性添加剂吸附到固定相表面形成非对映复合物，以此实现手性分离[12]。Salvador 等[13]通过向超临界二氧化碳与改性剂的混合物中加入手性选择剂二甲基化-β-环糊精混合物，创造手性环境，最终实现手性分离。

2.1.3 添加剂 在应用超临界流体色谱法分离碱性或酸性异构体时，由于该类化合物易于离子化，与固定相作用强烈，导致化合物色谱峰展宽，甚至无法洗脱[14]，通常需要加入碱性或酸性添加剂，如三氟乙酸、二乙胺、三乙胺等，以改善化合物的色谱峰形，或者改变它们的保留机制。

Speybrouck 等[14]发现，当添加剂浓度改变，超出常用浓度范围时，可能会影响手性化合物的保留时间、峰形、选择性及分离度等。通常来说，加入添加剂，化合物的峰形变得更加尖锐，而添加剂对于化合物保留时间、选择性、分辨率的影响则与化合物本身性质有关。常用的添加剂浓度一般在 0.3% ~ 2% 范围内，添加剂浓度增加可能反而会使得异构体分离度下降。

2.2 手性固定相

HPLC 中使用的手性色谱柱基本上可以直接在 SFC 上使用。随着 SFC 技术的普及，可用于 SFC 的手性固定相（chiral stationary phase，CSP）种类越来越多，常见的主要有以下几种。

2.2.1 环糊精及大环抗生素手性色谱柱 环糊精是由吡喃葡萄糖通过 1,4-苷键连接并互为椅式构象的环状低聚糖化合物。根据吡喃葡萄糖单元的数目，由 6 个葡萄糖形成的六聚体为α-CD，7 个葡萄糖形成的七聚体为 β-CD，8 个葡萄糖形成的八聚体为 γ-CD[15]。环糊精分子具有相对疏水的内部手性空腔及被羟基包围的亲水性外表面。内部的手性空腔对芳烃或者脂肪烃类侧链具有包容作用，并且外侧的羟基能够与分析物发生氢键相互作用及偶极-偶极相互作用，实现异构体的分离[5]。目前较为常用的手性固定相是环糊精的衍生物。将环糊精衍生之后，不仅能够增加空腔大小，改变其疏水性，还能够以此引入其他手性识别位点，增加手性固定相的异构选择性[16]。

基于大环抗生素类的手性固定相，例如万古霉素、替考拉宁等，在 SFC 中也有应用。大分子结构中通常含有多个手性相互作用位点，因而显现出较为广泛的对映选择性。它们均由数个大环稠合而成的“提篮状”糖苷配基与糖相连组成。其中糖苷配基由 3 或 4 个大环组成，含醚键、酰胺键、肽键等[12]。一般来说，万古霉素作为选择剂的固定相对于碱性化合物的分离效果较好，替拉考宁适用于酸性及碱性化合物的分离，而瑞斯托菌素则只适用于酸性化合物的分离[5]。

2.2.2 Pirkle 型手性色谱柱 Pirkle 型手性色谱柱在20 世纪 70 年代被开发，是将单分子层的手性有机分子，如含末端羧基或异氰酸酯的手性选择剂，通过适宜的连接基团键合到硅胶载体上制得的[17]。分析物与固定相之间的作用主要是 π-π 相互作用，也包括氢键相互作用、偶极-偶极作用、空间相互作用等。

这一类型的手性固定相主要通过手性选择剂及分析物之间的三点作用实现异构选择，即手性选择剂与一个异构体形成三点作用，而与另外一个异构体形成两点作用。与选择剂形成的复合物稳定性不同导致异构体保留时间不同，从而实现异构分离[18]。

2.2.3 基于多糖的手性固定相 由于具有来源广、异构选择能力强等优点，目前基于衍生多糖的手性固定相在SFC 中使用最为广泛，包括纤维素和直链淀粉酯、纤维素苯基氨基甲酸酯、直链淀粉苯基氨基甲酸酯、其他多糖氨基甲酸酯、区域选择性取代的多糖衍生物等，其中纤维素及直链淀粉的 3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯应用最为广泛[19]。在结构中引入吸电子基团，如氟原子，或者引入给电子基团，如烷基等，会增加固定相的异构选择能力，例如目前常用的纤维素三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）固定相[5]。不同多糖衍生物手性识别能力不同可能是由于各衍生物的螺旋结构存在差异，构象稳定性不同造成的[12]。由于涂覆类多糖手性固定相的溶剂耐受性较差，现多采用在二氧化硅基质上共价结合手性选择分子的方式制备手性固定相[19]。2004 年，大赛璐公司开发出了第一款直链淀粉-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）固定手性色谱柱，商品名为 Chiralpak IA。

2.3 柱温和背压

在 SFC 中，柱温及背压也是方法优化需要考虑的对象。在温度固定的情况下，随着背压的增加，分析物的保留时间减小[20]。但压力对流动相密度的改变程度与流动相的组成具有密切关系。

当流动相只有可高度压缩的二氧化碳时，压力的改变对流动相密度影响较大。而当流动相中改性剂比例较大时，压力的改变对于流动相密度的改变[8]及化合物的保留时间影响较小。

温度的改变对保留时间的影响较为复杂，其改变对溶质的蒸汽压、超临界流体的密度、溶质及超临界流体的溶解度参数、溶质与固定相之间的相互作用等均有影响[20]。

综合来说，影响保留时间的主要参数为压力及改性剂百分比，而影响选择性的主要参数为温度及改性剂的百分比[21]。在方法开发过程中，首先主要考察固定相及流动相（改性剂及添加剂），之后再针对实验结果，对温度及背压两参数进行优化。

3 超临界流体色谱法在手性药物分离方法开发中的应用

Segawa 等[22]通过超临界流体色谱-质谱联用法，利用 Trefoil CEL2 色谱柱对甲基苯丙胺进行手性分离。采用 CO2:MeOH:NH3= 92.5:7.5:0.11 作为流动相，流速为1 ml/min，柱温为 10 ℃，背压为 17.2 MPa。优化后的色谱条件可以成功将甲基苯丙胺对映体分离。

Li[23]比较了高效液相色谱法-单四级杆质谱（HPLC-SQD）以及超临界流体色谱法-单四级杆质谱（SFC-SQD）对甲吗喃的分离效果，两种方法均具有较高的选择性及灵敏度。HPLC-SQD 法使用 Chirobiotic V2色谱柱，流动相为 MeOH:NH4OH:HOAc = 100:0.02:0.1，在9 min 内将甲吗喃对映体分离。SFC-SQD 使用 Trefoil AMY1色谱柱，流动相为 CO2:MeOH:环己胺 = 91:9:0.3，3 min 内完成分离。检测限均为 10 ng/ml。较短的运行时间，彰显了 SFC 的优势。

Berger 和Berger[24]通过超临界流体色谱法对维生素 K1 可能存在的 8 种异构体进行分离。在 RegisPack色谱柱上，流动相为CO2:MeOH = 95:5、流速 2 ml/min、柱温 30 ℃、背压15 MPa 条件下，在 20 min 内实现 7 种异构体的分离。

杨杰锋等[25]采用超临界流体色谱法，利用 Chiralpak OD-H 手性色谱柱，以 CO2:MeOH = 89:11 为流动相，对非离子型水溶性碘造影剂碘帕醇进行异构体分离与定量。该法能够将碘帕醇中的两种异构体实现较好分离，较欧洲药典中的旋光度测定法，具有更好的专属性与准确性。

金薇等[26]建立了左乙拉西坦及其右旋异构体的超临界流体色谱手性拆分紫外检测方法。方法采用 Chiralcel OD 色谱柱，CO2:EtOH = 88:12 为流动相，流速为 2 ml/min，背压 15 MPa，柱温为 40 ℃，检测波长为 220 nm，进样体积为 5 μl。经过方法学验证，建立的方法可用于左乙拉西坦原料及制剂中右乙拉西坦的质量控制。

陈香玲和李丽[27]建立盐酸罗哌卡因注射液中异构体的超临界流体色谱检测方法。采用Dmcel Chiralpak AS 色谱柱，柱温为 40 ℃，检测波长为 220 nm，流速为 2.0 ml/min，背压为 12 MPa，流动相为 CO2:EtOH = 80:20。研究建立的方法简便、准确、灵敏，可用于注射液中异构体的检查。

戴慧雪等[28]通过超临界流体色谱法分离尼索地平、西尼地平、普拉地平、阿折地平、盐酸马尼地平 5 种 1,4-二氢吡啶类钙拮抗剂（1,4-DHPs）。采用 Sino-Chiral OJ 手性色谱柱，以超临界二氧化碳作为流动相，流速设为2 ml/min，检测波长设为 237 nm，考察不同改性剂种类（甲醇、乙醇、异丙醇）、比例以及系统背压（13 ~ 17 MPa）对分离效果的影响。该研究对于同类化合物的异构分离具有一定参考意义。

陈伟珠等[29]将 SFC 技术应用于 d4T-5'-N-磷酰化苯丙氨酸甲酯非对映异构体的分离，建立了 d4T-5'-N-磷酰化苯丙氨酸甲酯非对映异构体分离分析的超临界流体色谱方法。色谱柱为 Hypersil ODS2，流动相为 CO2:MeOH = 93:7，流速为 2 ml/min，柱温为 35 ℃，背压为 15 MPa，紫外检测波长为 254 nm。在优化条件下，d4T-5'-N-磷酰化苯丙氨酸甲酯的两种非对映异构体完全达到基线分离，分离时间约 15 min。该法可用于以上两种异构体的分离与检测。

金薇等[30]建立了胆固醇吸收抑制剂依折麦布及其对映体的超临界流体色谱手性拆分方法。方法采用 Chiralcel OD 色谱柱，以 CO2:MeOH:三氟乙酸:三乙胺 = 90:10:0.1:0.1 为流动相，背压为 l5 MPa，进样量为 5 μl，柱温为 35 ℃，流速 3 ml/min，检测波长为 235 nm。研究建立的超临界流体色谱法分离效率高，重现性好，可有效用于依折麦布原料及制剂中对映体的测定及质量控制。

戴涛等[31]研究了超临界流体色谱法对齐留通对映体的拆分效果。采用 Chiralpak AD-H柱，流动相为 CO2:异丙醇 = 82:18，背压为 14 MPa，温度为 30 ℃，齐留通对映体分离度达到 11.5。

罗英豪[32]利用超临界流体色谱法拆分萘普生对映体。研究采用 Chiralpak AD-H 色谱柱，流动相为 CO2:异丙醇 = 80:20，背压 17 MPa，柱温 20 ℃，检测波长 283 nm。在此条件下萘普生对映体能够达到基线分离。

Toribio 等[33]通过超临界流体色谱法分离抗真菌药物联苯苄唑的对映体。研究采用 Chiralpak AD 色谱柱，重点研究改性剂及温度对异构分离的影响。研究结果显示，在 Chiralpak AD 色谱柱上，联苯苄唑能够实现异构分离。研究中考察的甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈 4 种改性剂均可分离两异构体，但醇类改性剂分离效果优于乙腈，乙腈条件下异构体的保留较强。

Bao 等[34]通过直链淀粉手性色谱柱实现()帕罗西汀合成中关键前体——外消旋帕罗醇的异构拆分。色谱柱为 Chiralpak AD-H，柱温为 15 ℃，背压为 150 MPa，以保留因子与分离度为指标，考察甲醇、乙醇、异丙醇对分离效果的影响。结果显示，当改性剂为 5% 甲醇时，分离效果最佳。

李冬艳等[35]以大赛璐键合型多糖系列柱Chiralpak IA、IB、IC、ID、IE、IF 为实验对象，利用超临界流体色谱法对 11 种手性化合物进行分离，也对改性剂种类、浓度、碱性添加剂以及特殊改性剂对 SFC 手性分离的影响进行了讨论。6 种色谱柱对于实验中研究的 11 种手性化合物分离具有较好的互补性，均能够在 10 min 内得到较好的分离效果。

West 等[36]通过超临界流体色谱法，利用 7 种多糖固定相，对 24 种含有手性硫原子的亚砜化合物进行手性分离。7 种固定相中氯代纤维素固定相对于手性化合物的保留与选择性能最好。研究发现，手性分子采取 U 型构象时，手性固定相的分离能力较好，而采取线性构象的分子不易被识别。这也在一定程度上揭示了该手性识别过程为构象驱动。

Pokrovskiy 等[37]发现，利用超临界流体色谱法分离苯基异丁基酮肟构型及构型两异构体时，共溶剂比例发生改变，两异构体洗脱顺序发生改变。这种洗脱顺序的翻转主要是由两种相互作用相互平衡转移造成的。在醇类共溶剂比例较低时，固定相表面仅被醇类分子轻微覆盖，所以肟主要通过氢键与吸附位点相互作用。由于-肟的羟基朝向苯基环，空间位阻导致羟基很难形成氢键，因此首先被洗脱。在醇类共溶剂比例逐渐增加时，它们占据二氧化硅表面上大部分氢键位点，此时非特异性静电相互作用占据主导作用。-肟具有比-肟更大的偶极矩，洗脱慢。

Kalíková 等[38]利用超临界流体色谱法，以纤维素三-（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）色谱柱作为固定相，对理化性质存在差异的 21 种化合物进行了分离。实验中考察了两种改性剂（甲醇及异丙醇）、五种添加剂（二乙胺、三乙胺、异丙胺、三氟乙酸及异丙胺与三氟乙酸同时加入）对实验的影响。对于大部分异构体来说，能够实现异构分离的最优条件为CO2:MeOH:异丙胺 = 80:20:0.1，或者是 CO2:异丙醇:异丙胺:三氟乙酸 = 80:20:0.05:0.05。实验中对 β 受体阻断剂的分离效果最佳。利用 HPLC 进行分离时，最优条件为己烷:异丙醇:添加剂 = 80:20:0.1。SFC 与 HPLC 相比，能够在较短时间内实现较好的分离，但实验中也存在 HPLC 分离效果优于 SFC 的情况。

庾莉菊等[39]利用超高效合相色谱法测定盐酸兰地洛尔中立体异构体的含量，选用 Daicel Chiralpak IF 手性色谱柱，以超临界二氧化碳为流动相，MeOH:正丁醇:ACN = 1:1:1 + 0.5% 氨水为改性剂，流速为 2.8 ml/min，采用梯度洗脱的方式，检测波长为 223 nm。该研究建立的方法能够满足盐酸兰地洛尔样品中 3 个立体异构体检查的相关要求。

李士敏等[40]利用超高效合相色谱法拆分卡多曲对映体，采用 Lux Cellulose-2手性色谱柱，CO2:MeOH = 60:40 为流动相，流速为 1 ml/min，柱温为 40 ℃，动态背压为 13.79 MPa，进样量 1 μl。在优化后的色谱条件下，卡多曲对映体实现基线分离。

王波等[41]利用超高效合相色谱法拆分芳樟醇异构体，采用 Capcell Pak Chiral CD-Ph手性色谱柱，CO2:ACN = 97:3 为流动相，等度洗脱，流速为 1.2 ml/min，检测波长 215 nm，柱温 30 ℃，背压为11.7 MPa。研究中考察了有机改性剂、柱温、动态背压和进样量等条件对分离的影响，利用优化后的条件进行分析仅需 3 min，并且实现了芳樟醇的基线分离。

4 展望

随着 SFC 仪器的逐步商业化及越来越多的手性固定相被开发，SFC 在手性药物分离领域应用越来越广泛。SFC 分离手性化合物分析速度较快，分离效率较高，并且对有机溶剂的消耗较少，绿色环保。有理由相信 SFC 在手性药物分离领域会有更加广泛、深入的应用。

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山广志，Email：shanguangzhi@imb.pumc.edu.cn

2018-09-14

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.01.013