Ca2＋信号通路调控肌纤维类型转化的研究进展

侯普馨，侯艳茹，白艳苹，苏 琳，赵丽华，靳 烨*

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

肌纤维是肌肉组织的基本组成单位，其类型是决定肉品品质的一个重要因素。肌纤维的密度、数量、直径、横截面积、不同类型肌纤维的数量比例以及面积比例都与肉品品质密切相关[1]。特别是当肉品中氧化型肌纤维所占比例高时，肌肉的pH值、肉品的风味、颜色、大理石纹评分和肌内脂肪含量较高，肌肉系水力强、细嫩多汁、肉质良好。目前通过改变肌纤维类型组成从而改善肉品品质已经成为肉品科学领域的研究热点[2]。

骨骼肌的可塑性较强，当机体受到刺激时，骨骼肌能够激活细胞内相关的信号通路，使肌纤维特异性基因的表达改变，从而使得肌纤维类型发生改变以适应需求[3]。大量研究均表明，肌纤维类型的转化遵循I型（慢收缩氧化型）→IIa型（快收缩氧化酵解型）→IIx/d型（中间型）→IIb型（快收缩酵解型）的转化路径。肌纤维类型的转化受到多种信号通路的调控，如单磷酸腺苷活化蛋白激酶通路、过氧化物酶体增殖物激活受体通路、Wnt/β-连环蛋白通路、大鼠肉瘤蛋白/细胞分裂素活化蛋白激酶通路等。研究较多的两条途径分别为钙调神经磷酸酶/T细胞核因子（calcineurin/nuclear factor of activated T cells，CaN/NFAT）和生肌调节因子途径，其主要是细胞内Ca2＋浓度和代谢产物的变化激活了下游信号分子通路，从而调节与肌纤维类型相关的基因，引起肌纤维类型发生转变[4]。本文总结了CaN与钙调蛋白激酶（calmodulin kinase，CaMK）的组成结构、Ca2＋信号通路调控肌纤维类型转化的作用机理、影响Ca2＋信号通路调控的主要因素以及Ca2＋信号通路与肉品品质的关系，以期为今后通过遗传、营养等措施改善肉品品质提供理论依据。

1 Ca2＋信号通路

Ca2＋信号通路包括CaN和CaMK两条Ca2＋依赖性信号传导途径，其被激活都会促进快肌纤维向慢肌纤维转化。

CaN又称蛋白磷酸酶2B，是迄今为止发现的唯一受Ca2＋/钙调素（calmodulin，CaM）活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶[5]。在20世纪70年代末至80年代初，美国和加拿大的研究者在猪脑中发现CaN并将其分离纯化，后来逐渐发现其几乎分布在不同组织和多种类型的细胞当中[6]。CaN是由分子质量约为59 kDa的催化亚基（CnA）和分子质量约为19 kDa的调节亚基（CnB）按1∶1比例形成的异型二聚体。CnA的氨基端是磷酸酶结合域，中间是CnB和CaM的结合域，羧基端是自抑制域。CnA是全酶催化的核心，CnB和CaM可将其激活[7]。无刺激状态时，自抑制域形成α-螺旋封闭酶的底物结合区域，此时α-螺旋封闭酶处于失活状态；当它被CnB和Ca2＋/CaM结合到对应的结合位点时，抑制域结构发生改变，活化位点暴露出来，从而引起变构反应，此时α-螺旋封闭酶被激活[8]。

CaMK则是一种丝氨酸/苏氨酸特性的蛋白激酶，被钙/钙调蛋白复合物所调节[9]。CaMK包含一个氮末端的催化区、一个调节区和一个联合区[10]。

2 Ca2＋信号通路与肌纤维类型转化

2.1 CaN途径

1993年Jain等研究发现NFAT可以被CaN脱磷酸化[11]。1996年Schreiber等通过免疫应答反应发现了CaN是免疫抑制剂环孢菌素A（cyclosporin A，CsA）、他克莫司（tacroclimus，FK506）的靶向蛋白，且CsA能阻碍NFAT的移位[12]，这使得CaN逐渐成为研究热点。1998年Chin等研究得出骨骼肌中的CaN可以选择性上调慢肌纤维特异性基因的启动子；相反，加入CsA能抑制CaN的活性而导致慢肌纤维向快肌纤维的转化，并推测是由NFAT和肌细胞增强因子（myocyte enhancer factor，MEF）2家族的蛋白质组合机制介导慢肌纤维特异性转录[13]。2000年Naya等通过调控肌酸激酶构建了表达CaN活性的转基因小鼠，研究证明在体内活化的CaN能诱导慢肌纤维的基因表达，且单独活化CaN不足以引起骨骼肌肥大[14]。2006年Miyazaki等以8 周龄的雌鼠为实验材料，先将其后肢悬浮处理8 周，随后再负载4 周并给予腹腔注射CaN抑制剂FK506，通过对比目鱼肌的检测发现，在后肢悬浮期间，肌肉明显萎缩且有慢肌纤维向快肌纤维转化的趋势。在再负载时，肌肉开始生长，比目鱼肌又向慢肌纤维逆转，FK506的灌注会抑制CaN的活性从而阻止慢肌纤维的维持和再生[15]。因此，CaN在维持和悬浮再负载的慢肌纤维中都发挥重要作用。2007年Mu Xiaodong等运用微阵列追踪骨骼肌特异性基因的表达，研究发现静息培养小鼠趾短屈肌3 d，会发生快肌纤维向慢肌纤维的转化，如果加以电刺激模拟神经支配，转化会进一步加快，但过表达CaN却不能使转化彻底进行[16]，这也表明CaN途径在肌纤维特异性表达与转化机制中是必不可少的。2010年Yuan Yuan等发现在C2C12成肌细胞中，组成性活化的FoxO1突变体改变了肌纤维的组成比例，使得肌纤维向快速酵解型转变，并降低了CaN的活性[17]。一系列小鼠模型实验均证明，抑制CaN活性使得大鼠比目鱼肌中Ⅰ型肌纤维比例下降，Ⅱ型肌纤维比例升高[18]；敲除CaN基因也会得到同样结果；过表达CaN基因使氧化型肌纤维比例升高，酵解型肌纤维比例降低[19]，这均表明CaN对慢肌纤维基因的调控发挥着重要作用。综上所述，CaN在肌纤维类型转变、骨骼肌分化过程中发挥着重要作用，是骨骼肌重塑的重要信号分子。其他研究还表明，CaN参与糖代谢、脂肪酸氧化、血管平滑肌细胞增殖、细胞因子产生等过程[20]。

随着研究的深入进行，CaN和转录调节相偶联的作用机理逐步被揭示出来。CaN的主要作用底物是NFAT，在NFAT的作用下，可以提高多种表达Ⅰ型肌纤维的基因表达水平[21]。在体内，骨骼肌受到运动神经支配，运动神经元引发肌纤维产生动作电位。在慢肌纤维中，神经冲动引起细胞质中Ca2＋长期持续的低振幅变化，这种变化能够激发肌细胞内Ca2＋浓度不断升高，使得细胞中的Ca2＋浓度维持在100～300 nmol/L，此时Ca2＋与CaM相结合激活CaN，使得NFAT去磷酸化，暴露核定位信号，NFAT从细胞质转位到细胞核，与其他转录因子协同调节在慢肌纤维中特异性表达基因的活化，促使慢肌纤维表达。而在快肌纤维中，神经冲动引起细胞质中Ca2＋短期持续的高振幅变化，使Ca2＋浓度维持在较低水平（低于50 nmol/L），该条件下不足以激活CaN，也就不能使NFAT去磷酸化入核，不能发挥对快肌纤维基因表达的调控[22-23]。对此，一些研究者也提出异议，2000年Swoap等发现在C2C12肌管中超表达CaN，可以同时激活慢肌和快肌的启动子，然而超表达NFAT却不能诱导快肌/慢肌特异启动子的表达[24]。2001年Allen等研究发现在快肌纤维的启动子区域包含多种NFAT的结合位点，超表达CaN可以活化这些快肌纤维基因[25]。CaN途径涉及多种调控因子的参与，且肌纤维的发育受到多种因素的影响，具体的调控机制还有待进一步探索验证。

2.2 CaMK途径

2008年Smith等通过大鼠游泳实验发现，游泳运动后大鼠葡萄糖转运子4（glucose transporter 4，GLUT4）mRNA和蛋白质均显著增加。若运动前给大鼠腹腔注射KN93（CaMK抑制剂），则导致CaMK磷酸化、组蛋白H3乙酰化、MEF2A结合与GLUT4的表达降低或消除[26]。2012年Ou Na等用马血清诱导C2C12细胞分化，用低频率慢型电刺激结合CsA或KN93处理，得到CsA和KN93能够抑制体外C2C12细胞分化模型中肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MyHC）I mRNA和蛋白质的表达，且证明低频率慢型电刺激处理可以促进MyHCⅡ的转化[27]。因此CaMK在调控肌纤维类型转化中也发挥重要作用。

肌纤维中瞬时升高的Ca2＋浓度可以将CaMK激活，在磷酸化组蛋白脱乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）的作用下从细胞核转移至胞浆，进一步活化MEF2，参与I型肌纤维基因转录的调控。激活的CaMK还可以通过腺苷-3’,5’-环化一磷酸应答元件结合蛋白结合到过氧化物酶体增殖物激活受体辅助活化因子（transcriptional peroxisome proliferator-activated receptor α coactivator-1，PGC-1α）启动子上，进而调控肌纤维类型转化[28-29]。现已发现CaMK家族包括CaMK I～IV 4 个成员，研究认为只有CaMK II、IV参与快肌纤维向慢肌纤维的转化过程[30]。CaMK II可引起与肥大反应相关的血清反应因子磷酸化，其可促进葡萄糖运输，提高氧化能力。在心肌细胞中，CaMK IV在256～498氨基酸残基上磷酸化HDACs，并从MEF2结合位点上解离，暴露与其他蛋白相结合的位点，移位进入细胞质，这一过程通过染色体区域稳定蛋白1依赖性出核运输机制实现[31]。2007年在Mu Xiaodong等进行的趾短屈肌细胞培养实验中发现，虽然肌肉表型已发生转变，但CaMK IV活性并没有改变[16]。2004年Akimoto等证实了在小鼠的骨骼肌中不表达可以检测的CaMK IV蛋白活性，因此推测CaMK IV可能不是维持MyHC IIb向MyHC IIa转换所必需的介质，与之协同作用的其他蛋白激酶可能作为参与肌纤维类型转化的内源性介质[32]。且2004年Wright等在大鼠肌肉中也未证实CaMK IV mRNA的存在[33]，因此CaMK的作用机理还存在争议。

2.3 影响Ca2＋信号通路调控的因素

目前对于CaN和CaMK途径的研究主要集中于调控肌纤维发育的关键转录因子、功能基因、相关抑制剂以及运动对其影响的研究。在转录因子中，CaN的主要作用目标是NFAT家族成员和MEF2，且MEF2也是CaMK途径的研究重点。

2.3.1 活化T细胞核因子

NFAT是一种转录因子，最初被发现于参与T细胞的信号传导。迄今共发现5 种NFAT亚型，分别为NFATc（NFATc1或NFAT2）、NFATp（NFATc2或NFAT1）、NFAT4（NFATc3或NFATx）、NFAT3（NFATc4）、NFAT5[34-35]。CaN主要是基于NFATc1发挥作用，促进慢肌纤维的生长、修复，抑制快肌纤维肌球蛋白重链基因的表达[36]。2000年Swoap等发现NFAT能选择性应答慢型小α运动神经元的活动[24]。1998年Chin等发现一些慢肌特异性基因的调控区含有NFAT和MEF2因子的结合位点[13]。2004年Mccullagh等将合成的肽抑制子导入比目鱼肌中，导致CaN无法激活NFAT，使得MyHC I型基因表达下调，IId/x型肌球蛋白重链表达上调[37]，这揭示了在慢型肌球蛋白重链基因的表达中NFAT活性的必要性。2013年Yamaguchi等通过过表达实验和siRNA介导的干扰实验证实NFATc2和NFATc4参与着MyHC I的调控，敲除NFATc1时会引起心脏发育缺陷而导致胚胎死亡，敲除NFATc2和NFATc3会引起肌肉萎缩[38]。在啮齿动物骨骼肌细胞快肌纤维向慢肌纤维转化过程中，MyHC I基因表达的上调与NFATc1参与有关[39]。2013年Vechetti-Júnior等对大鼠进行了8 周的游泳耐力训练，与不运动的对照组相比，有氧运动诱导了比目鱼肌中肌纤维由I型向IIa型转化，趾肌中肌纤维由IIb型向IIa转化，且NFATc1-c3基因表达增加，而NFATc4和CaN的表达量没有改变，由此证明了有氧运动引起的肌纤维类型转化是由NFATc1-c3介导的[40]。

2.3.2 肌细胞增强因子

MEF2是最早发现于骨骼肌肌管中的一种蛋白质，在脊椎动物中包括MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D 4 个成员[41]。作为一种关键的生肌调控转录因子，MEF2可以激活肌肉特异基因的表达从而促进骨骼肌的发育[42]。CaN可以通过MEF2和PGC-1α启动子上MEF2-BS位点结合后调节肌纤维类型的转化[43]。2007年Potthoff等通过转基因小鼠发现过表达MEF2可以促进小鼠慢肌纤维的形成，当添加MEF2特异性抑制剂来抑制其活性时则降低了小鼠慢肌纤维的形成[44]。2009年Hennebry等研究发现，肌肉生长抑制剂在促进慢肌纤维形成时，可以上调MEF2C的水平，但负调控成肌分化抗原的表达[45]。

2.3.3 运动

运动可以通过调节CaN途径影响肌纤维类型的转化[3]。2008年廖八根等通过耐力运动实验发现，CaN参与肌纤维类型和大小的调控[46]。2010年吴金富研究发现再负荷离心运动可以激活细胞中Ca2＋，并通过CaN调节肌纤维类型的转化[47]。2017年尹丽琴等通过对大鼠高、中等强度的运动实验得出运动可以提高CaN的活性及NFATc1蛋白质的表达[48]。当机体持续处于低能量负荷的耐力运动时，骨骼肌细胞内Ca2＋浓度持续上升，CaMK被激活，MEF2活化，从而诱导慢肌纤维表达[49]。对人进行自行车运动强度测试，发现运动1 min内，CaMK II活性迅速升高，并随着时间延长持续升高，运动强度提升使其活性升高更快[50]。2000年Flück等对大鼠进行轮跑运动实验发现运动可以使得大鼠股外侧肌CaMK II活性升高[30]。这些研究均表明运动可以提高CaMK的活性，进而促进肌纤维类型发生转化。

2.3.4 其他

越来越多的研究表明，胰岛素样生长因子（insulin like growth factor，IGF）在动物发育，特别是骨骼肌发育中发挥重要作用。2013年Hudson等研究发现IGF-1能激活CaN及其底物NFAT，在调节肌纤维类型转化以及促进肌管的增殖和肥大中发挥着重要作用[51]。1999年Musarò等给有丝分裂后期的大鼠L6E9骨骼肌细胞转染IGF-1基因，引起肥大肌纤维中CaN亚基的基因转录和细胞核定位[52]。2015年束婧婷等研究得出IGF-1、CnAα、NFATc3 3 个基因在鸭早期骨骼肌中协同表达，在腓肠肌外侧头肌纤维类型存在由酵解型肌纤维向氧化型肌纤维转化的趋势[21]。

环孢霉素A是CaN的特异性抑制剂，可以抑制低频电刺激诱导的II型肌纤维向I型肌纤维转化。2001年Serrano等用环孢霉素A和免疫抑制剂FK506抑制CaN的活性，发现在比目鱼肌再生初期，MyHC IIa表达量增加，MyHC IIx、MyHC IIb表达量下降[53]。

在近些年的研究中，Sharlo等发现，功能卸载的大鼠比目鱼肌中的NO水平下降，会激活糖原合成酶激酶-3β，从而促进NFATc1从细胞核输出和快肌球蛋白的稳定。而机体内的NO由一氧化氮合成酶合成，这就可以猜测一氧化氮合成酶也参与了慢肌纤维的形成过程[54]。Fajardo等验证了过表达肌脂蛋白以及肌浆网Ca2＋-ATP酶调节剂能够刺激CaN信号途径从而增强骨骼肌的氧化能力[55]。Lomonosova等通过将大鼠后肢悬吊使得其骨骼肌功能卸载，发现在该条件下MyHC I型的表达下降，而上调IIa、IIb和IId/x型表达[56]。

3 Ca2＋信号通路与肉品品质的关系

Ca2＋信号通路对肌球蛋白重链的表达具有调控作用，CaN途径与CaMK途径均能促进酵解型肌纤维向氧化型肌纤维转化，该通路被认为是影响慢肌纤维肌球蛋白重链亚型表达中最重要的一条信号级联放大通路[57]。了解Ca2＋信号通路调控肌纤维类型转化的机制非常重要，其有望为改善畜禽肉品品质提供新途径。

肉品品质指标包括感官指标、食用指标、卫生指标、营养指标等，通常在食用安全的情况下，消费者会选择有光泽、有大理石花纹、肌肉细嫩多汁的肉[58]，而肌纤维类型对这些肉品品质性状均有影响。氧化型（I和IIa型）肌纤维与酵解型（IIb）肌纤维的组成及增长趋势对产肉量、营养成分含量、质构特性具有直接的影响。肌肉中氧化型肌纤维所占比例越大，酵解型肌纤维比例越小，肌肉品质越高[59]。肌纤维类型对肉品品质影响主要包括嫩度、系水力、风味、色泽等。

肉的嫩度是消费者最重视的食用品质之一，它决定了肉在食用时口感的老嫩。肉的嫩度在本质上取决于肌纤维类型、直径、密度等因素。氧化型肌纤维形态纤细，而酵解型肌纤维直径较粗，因此肌肉的剪切力会随着酵解型肌纤维比例的增多而增大，嫩度则下降[60]。Ryu等研究发现肉的嫩度、色泽与氧化型肌纤维含量呈正相关，而与酵解型肌纤维含量呈负相关，这说明酵解型肌纤维含量所占比例越大，肉品品质越差[61]。肌肉中Ⅰ型肌纤维的含量与肉品品质的多汁性和风味呈正相关[60]。与酵解型肌纤维相比，氧化型肌纤维有更高含量的磷脂，磷脂是决定肉品风味的重要因素[62]。氧化型肌纤维中含有丰富的肌红蛋白和血红蛋白，因此当氧化型肌纤维所占比例高时，肌肉呈现鲜红色[63]。而酵解型肌纤维中肌红蛋白的含量低，有较高活性的ATP酶和较多的糖原，当酵解型肌纤维所占比例高时，肌肉会显得苍白，宰后胴体pH值下降速度快，甚至产生灰白肉[64]。因此，当肉品中氧化型肌纤维所占比例高时，肌肉的pH值、肉品的风味、颜色、大理石纹评分和肌内脂肪含量较高，肌肉的系水力强，肌肉细嫩多汁，肉质良好。

4 结 语

综上所述，CaN和CaMK信号途径在肌纤维类型转化中均发挥重要作用。近年来，随着生物技术的迅速发展，许多研究者开始从基因组学、蛋白组学方面入手研究与肌纤维类型转化相关的特异性表达的基因以及信号通路，从而深入揭示其调控机制。但就目前而言，CaN与CaMK活性/含量对肉品品质的影响的相关研究还不够深入，对于参与Ca2＋信号通路的调控因子以及该通路与其他信号通路间的具体联系，也有待进一步探索与研究。深入研究该通路中的重要调控因子及差异表达的基因，将有助于今后通过遗传、营养等措施改善肉品品质。