茵陈蒿汤防治大鼠非酒精性脂肪性肝病效果及其对肝组织NTCP表达的影响

付亚坤，闫丽辉，李新，管乐，李望，穆标

(1天津中医药大学，天津300193；2国家卫生健康委员会激素和发育重点实验室 天津市代谢性疾病重点实验室 天津医科大学代谢病医院内分泌研究所；3 天津医科大学基础医学院)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化[1,2]。目前，NAFLD在全世界的患病率约为25.24%[3]；近10年，我国NAFLD患病率高达26%～45%，已逐渐取代慢性病毒性肝病成为慢性肝病之首[4,5]。乏力是NAFLD最常见的症状，但因缺乏特异性临床体征易被忽略[6]。胆汁酸的摄取、转运与排泄的异常均可导致肝细胞损伤[7]，钠离子牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)是胆汁循环的重要因素。有研究发现，NASH患者血浆胆汁酸水平明显升高，且胆汁酸通过激活Fas和TRALL死亡受体，引起线粒体功能障碍，增强NASH患者体内的脂质过氧化反应，诱导肝细胞凋亡，加速肝细胞坏死，最终导致肝纤维化和肝硬化。目前，NAFLD治疗上以调整膳食和生活方式为主，西医尚缺乏理想的、有针对性的特效药。茵陈蒿汤由茵陈蒿、栀子、大黄组成，具清热利湿、利胆退黄之功效。现代研究发现，茵陈蒿汤有松弛胆管扩约肌、促进胆汁分泌、增加胆汁中胆酸和胆红素排出量等功效，对慢性肝病有改善作用[8,9]，但对于NAFLD的治疗作用及机制仍不明确。2017年5～10月，我们采用高脂饲料饮食诱导NAFLD大鼠模型，给予茵陈蒿汤干预，通过检测肝脏功能的改善进而探讨茵陈蒿汤对于NAFLD的防治作用及其可能的分子机制，为中药治疗NAFLD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与饲料 雄性SD大鼠45只，体质量200 g，购于北京维通利华公司，实验动物许可证号：SYXK(津)2016-0012。基础饲料和高脂饲料(88%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇)，购于北京维通利华公司。所有动物饲养于天津医科大学动物房，室温恒定，经过适应性喂养，饮食、饮水正常者，无不良反应，纳入实验。本研究已经通过天津医科大学动物伦理委员的批准。

1.1.2 试剂与仪器 丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)检测试剂盒、HE染色试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司，总胆汁酸(TBA)、甘油三酯(TG)检测试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司。TRIzol试剂购自美国Life Technologies公司，Real time PCR检测仪及试剂盒购自美国ABI公司；NTCP引物序列上游5′-GGATGGAGGTGCACAACGTA-3′、下游5′-AAGGCAACGATCACCCCTTT-3′，GAPDH引物序列上游5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3′、下游5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′，由华大基因公司合成。NTCP、GADPH抗体及羊抗人lgG二抗均购自美国Abcam公司，羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗均购自中国ABclonal Technology公司，ECL化学发光试剂盒购自上海静融生物科技有限公司。

1.1.3 茵陈蒿汤制备 准确称取18 g茵陈蒿，加1 400 mL水煮沸，保持沸腾煎煮至700 mL；再加入9 g栀子和6 g大黄，再保持沸腾煎煮10 min；煎煮液纱布过滤，滤液浓缩至约1 g/mL，制成冻干粉。取冻干粉适量，用0.3%羧甲基纤维素钠溶液混悬，制成含生药1.2 g/mL的溶液。

1.2 实验方法

1.2.1 分组造模与药物干预 取预适应性喂养后的SD大鼠，随机分为3组各15只。模型组、干预组每天给予高脂饲料灌胃进行NAFLD造模，同时干预组每天给予茵陈蒿汤10 mL/kg灌胃，对照组每天给予普通饲料喂养。12周后分批处死，取大鼠尾静脉血及肝脏组织用于血清学、病理学及NTCP检测。

1.2.2 血清ALT、AST、TBA、TG检测 取大鼠尾静脉血，于2 500 r/min离心10 min后留取血清，生化分析仪测定血清ALT、AST、TBA、TG。

1.2.3 肝组织病理观察 取大鼠肝脏组织，用4%甲醛溶液固定24 h，脱水，石蜡包埋。常规切片，HE染色，镜检观察肝组织病理形态学变化。

1.2.4 肝组织NTCP mRNA检测 采用Real time PCR法。采用TRIzol试剂抽提肝组织总RNA，用相应试剂盒行逆转录和PCR反应。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环，72 ℃延伸3 min。采用2-ΔΔCT方法计算相对表达量，实验重复3次。

1.2.5 肝组织NTCP蛋白检测 采用Western blotting法。在低温环境中，将肝组织剪碎置于EP管中，按说明书加入NP-40和PMSF混合液；匀浆后将组织液移至预冷的EP管中；4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，吸取上清液置于预冷的EP管中。BCA法测定蛋白含量，按说明书将工作液和待测蛋白加入96孔板。用10% SDS-PAGE胶电泳，冰浴转PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭过夜；加入NTCP、GADPH一抗(1∶1 000)孵育，4 ℃过夜后用PBST洗涤3次；加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)，室温37 ℃孵育60 min后用PBST洗涤3次；ECL显色，X线曝光、显影、定影。实验重复3次。采用Image J软件进行定量和分析条带，以目的蛋白与内参光密度比值表示蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 茵陈蒿汤对大鼠血清ALT、AST、TBA、TG水平的影响 见表1。

表1 各组血清ALT、AST、TBA、TG水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 茵陈蒿汤对大鼠肝组织病理的影响 与对照组比较，模型组肝组织外观呈现明显的脂肪肝样病变，颜色灰白，表面可以见许多脂肪颗粒；HE染色显示，模型组肝组织呈现中度脂肪变性，可见空泡样变性和炎性细胞浸润，并可见棕黄色胆汁淤积颗粒，提示发生了NAFLD。与模型组比较，干预组大鼠肝组织外观大体正常，肝组织内脂肪变性、炎性细胞浸润、胆汁淤积均有一定程度缓解。见图1。

注：A为肝组织外观图；B为肝组织HE染色图。

图1各组肝组织病理结果

2.3 茵陈蒿汤对大鼠肝组织NTCP表达的影响 见表2。

表2 各组大鼠肝脏组织NTCP表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

体内胆汁酸呈疏水性，主要与甘氨酸发生反应[10]，对脂类物质的消化和吸收起重要作用，维持着机体的稳态；但同时胆汁酸也具有细胞毒性作用，特别是疏水性胆汁酸可增强NALFD患者体内脂质过氧化反应，诱导肝细胞凋亡，加速肝细胞坏死，最终导致肝纤维化和肝硬化。而胆汁酸的肠肝循环，特别是鹅脱氧胆酸，也进一步导致疏水性次生胆汁酸增加[11]。本研究结果显示，模型组大鼠血清TBA水平较对照组升高，病理检查显示其肝组织发生空泡样变性、炎性细胞浸润并出现棕黄色胆汁颗粒，提示NALFD与胆汁酸有关，与相关文献[12]报道相符。

实验表明，肝细胞胆汁酸转运体相关基因在肝脏病变时表达降低或者先天缺失，都会引起胆汁运输障碍，导致肝脏血窦系统摄取胆盐减少，从而对肝脏产生毒性。NTCP、胆盐输出泵(BSEP)和多药耐药相关蛋白(MRP2)是编码胆汁转运系统中最重要的3种转运体的基因，也是在肝脏发生病变时其基因表达水平最常受累及的基因[13]。近几年研究发现，NTCP、BSEP和MRP2等蛋白都不同程度的参与胆汁的形成和分泌，可能参与NAFLD的发病过程[14～17]。一些最新的研究也表明，NTCP基因表达在肝纤维化早期升高而晚期降低，其表达水平的动态变化有可能提示肝纤维化的发展进程[11]。因此，NTCP基因可能是临床上治疗肝脏病变的潜在靶点，研究其表达水平的改变以及探索靶向该基因的治疗方法具有重要意义。NTCP位于干细胞的基底细胞膜上，主要是通过有机阴离子转运多肽(OATP)介导产生ATP的钠泵，将血液中胆汁酸盐从肝细胞泵出。研究表明，肠道重吸收入肝脏的胆汁酸有90%经过NTCP转运。因此，NTCP在肝脏病变时表达水平的变化，将严重影响胆汁酸的运输。本研究结果发现，在高脂饮食诱导的NAFLD模型组大鼠肝脏组织中，NTCP表达水平被抑制达到50%以上，同时其血清TPA水平增高幅度也近1倍，这说明NTCP表达水平下降与NAFLD时血液中胆汁酸水平增高有着明显的相关性。

目前，NAFLD发生机制不清楚，临床上西医缺乏特效治疗方法，仅局限于运动和饮食疗法，尚无针对疾病原因的药物治疗；同时降脂药大多对肝脏有损害，因此探索一条新的治疗途径具有重要意义。中医学认为，该病的发病机制为湿热与瘀阻导致气机失调，也有学者认为肝气郁结、疏泄失常是形成脂肪肝的首要因素。在中医理论中，肝主疏泄，是机体气血津液正常运行的重要保证，一旦功能失调，则会导致气机郁滞，三焦水道不利，气血津液运行、代谢障碍，湿、痰、瘀由此而生[18]。茵陈蒿汤始载于汉代张仲景所著《伤寒论》，“伤寒七八日，身黄如橘子色，小便不利，腹微满者，茵陈蒿汤主之。”依其变裁的栀子柏皮汤用治阳黄之热重于湿型，茵陈四逆散用治阴黄。经后世医家的临床实践，在茵陈蒿汤用治湿热黄疸的背景下，将其用于治疗临床常见的各种肝胆疾病[19]。方中茵陈清热利湿退黄为治疗肝病的要药，现代药理学研究认为其具有保护肝细胞膜完整性、防止肝细胞坏死、促进肝细胞再生的功能[20]；栀子通利三焦湿热，助茵陈清热利小便，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒之功效[21]；大黄泻热逐瘀，通利大便，使瘀、热、湿、浊从大便而下。三药相互作用，清利降浊，引湿热从二便而去[22]。查阅文献发现，目前茵陈蒿汤治疗NALFD的相关研究相对较少，因此我们建立了NALFD大鼠模型，并给予茵陈蒿汤进行干预。结果发现，干预组大鼠血清ALT、AST、TG、TBA水平较模型组降低，肝组织炎性反应和胆汁淤积明显减轻，且肝组织中NTCP表达水平升高。因此，我们推测茵陈蒿汤可能通过调节肝组织中NTCP表达，改善肝细胞内胆汁淤积，减轻NALFD炎症状态，从而改善肝脏功能，为NALFD的防治提供了新的方法和思路。