还原型谷胱甘肽对辐射损伤小鼠外周血细胞及肠损伤的影响

李雪娇，田红旗

(北京协和医学院中国医学科学院放射医学研究所 天津市放射医学与分子核医学重点实验室，天津300192)

随着核能及核技术的发展，人们经受电离辐射的潜在风险大大增加，不同类型的照射可导致不同类型的辐射损伤。急性放射病(ARS)是指机体在短时间内受到较大剂量电离辐射照射引起的全身性疾病，临床上主要表现为造血器官损伤、全血细胞减少、出血、肠道损伤，受致命感染的可能性显著增加，如果不防治，病死率极高[1～5]。因此，寻找一种有效的辐射防护剂来预防或减轻电离辐射对造血器官及胃肠道的损伤十分必要。谷胱甘肽(GLU)是一种天然存在于生物体内、含有巯基的三肽，有还原型和氧化型两种形式，生理条件下主要以还原形式存在[6～8]。还原型谷胱甘肽(GSH)作为体内重要的抗氧化剂，能够还原过氧化物，清除自由基，从而维持体内稳态[9～13]。因此，GSH在临床上主要用于整合解毒、延缓衰老、提高人体免疫力。此外，GSH可降低p53、p21表达水平，从而减少电离辐射诱导的细胞周期延迟，促进细胞生长[14]。因此，GSH可作为一种潜在有效的辐射防护剂。GSH在肠道中易降解，口服生物利用度较低[15]。2018年4～6月，我们选用腹腔注射的给药方式，研究不同剂量的GSH对急性辐射损伤小鼠外周血细胞和肠损伤的影响，旨在为GSH作为辐射防护剂进行深入研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 C57BL/6小鼠(SPF级)，雄性，6～8周龄，体质量19～20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK(京)2014-0004；饲养于中国医学科学院放射医学研究所SPF级动物实验中心，动物饲养条件合格证号SYXK(京)2015-0035。试剂和仪器：GSH购自上海笛柏生物科技有限公司，APC-CD3抗体、FITC-CD45R/B220抗体购自美国Biolengend公司，苏木素染液、伊红染液购自北京索莱宝科技有限公司；血细胞分析仪购自日本光电公司，型号MEK-T222K；流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司，型号Accuri C6；光学显微镜购自日本Olympus公司，型号CKX31-A12PHP；137Cs γ射线辐照源购自加拿大原子能有限公司，型号USD Autocell40。

1.2 GSH对受照小鼠外周血细胞影响的观察

1.2.1 动物分组、给药与照射处理 将25只小鼠随机分为5组各5只，A1、B1、C1组照前30 min腹腔注射200、100、50 mg/kg GSH，D1组照前30 min腹腔注射等量生理盐水，A1～D1组接受全身照射至吸收剂量为4 Gy(剂量率0.99 Gy/min)；E1组腹腔注射等量生理盐水，不照射。

1.2.2 外周血细胞数目与淋巴细胞比例检测 照射后第15天，将各组小鼠颈椎脱臼处死，摘除眼球，取血150 μL。用100 μL EDTA抗凝，用血细胞分析仪计数小鼠外周血WBC、RBC、PLT。另外50 μL，用红细胞裂解液裂解红细胞；加入APC-CD3抗体0.5 μL，FITC-CD45R/B220抗体0.5 μL，4 ℃下避光孵育1 h；用PBS洗去多余的抗体，用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞比例。

1.3 GSH对受照小鼠肠损伤影响的观察

1.3.1 动物分组、给药与照射处理 将25只小鼠随机分为A2、B2、C2、D2、E2组各5只，给药方法同1.2.1，仅照射剂量均改为10 Gy，照射方式均改为腹部局部照射。

1.3.2 小肠组织病理学观察 照射后第3天，将各组小鼠颈椎脱臼处死，取小肠组织；将其横向切开，用4%甲醛固定24 h；用石蜡包埋、切片，HE染色后于光学显微镜下观察小鼠小肠黏膜及绒毛组织的病理学变化。

2 结果

2.1 各组外周血细胞计数、淋巴细胞比例比较 与E1组比较，D1组外周血WBC、RBC、PLT及T淋巴细胞、B淋巴细胞比例下降(P<0.05或<0.01)。与D1组比较，C1组外周血RBC及T淋巴细胞、B淋巴细胞比例上升(P均<0.05)，B1组外周血WBC、RBC、PLT及T淋巴细胞、B淋巴细胞比例最高(P<0.05或<0.01)，而A1组外周血各指标差异无统计学意义。见表1。

表1 各组外周血细胞计数、淋巴细胞比例比较

注：与E1组比较，*P<0.05，**P<0.01；与D1组比较；#P<0.05，##P<0.01。

2.2 各组小肠组织病理学变化 各组小肠组织HE染色后显微镜下可见，E2组小鼠小肠黏膜绒毛排列整齐，表面结构完整，绒毛高度和隐窝深度均较大。与E2组比较，D2组小鼠小肠绒毛变短、排列较为杂乱，上皮脱落，隐窝变浅，腺体萎缩。与D2组比较，C2组小鼠小肠绒毛上皮脱落较少，绒毛结构较为完整，腺体未出现明显萎缩；B2组小鼠小肠绒毛结构完整，排列整齐有序，隐窝深度较大；A2组小鼠小肠绒毛上皮仍可见明显脱落，隐窝较浅，绒毛排列不规则。见图1。

图1 GSH对受照小鼠肠损伤的影响(HE，×40)

3 讨论

ARS是一种由于短时间内受到大剂量外照射引起的全身性疾病，可表现为造血系统、胃肠道和脑组织损伤。其中，骨髓型ARS以骨髓造血组织损伤为基本病变，临床上可表现为外周血WBC、RBC、PLT下降，出血，淋巴细胞、中性粒细胞比例减少，受致命感染的可能性大大增加。肠型ARS以严重的胃肠组织损伤为基本病变，肠道细菌进入血液循环可引起败血症，最终导致患者死亡[16,17]。因此，需要找到一种有效的方法来预防ARS，减轻电离辐射对造血系统和胃肠道的损害。所以，寻找一种有效的辐射防护剂，并验证其对ARS的预防作用具有十分重要的意义。

GSH作为抗氧化剂和自由基清除剂，在临床上主要用于保肝、解毒、抗衰老、提高人体免疫力；而且，有研究证明，GSH具有一定的辐射防护作用。例如：Pujari等[18]发现，GSH预处理可以保护细胞免受X射线所致的电离辐射损伤；Ray等[19]研究表明，随外源性GSH剂量的增加，其可降低辐射诱导的染色体畸变率和微核率。然而，由于一定量的GSH可以减少电离辐射诱导的细胞周期延迟，而过高剂量的GSH会影响DNA修复，在某种程度上还会诱发DNA链断裂及染色体畸变[20]，但过低的剂量可能无法产生辐射防护作用。因此，确定合适的GSH给药剂量，对于实现最大程度的辐射防护作用是十分必要的。

本研究分别观察了GSH在3个不同给药剂量下对受照小鼠外周血细胞和肠损伤的影响。对外周血细胞研究的结果表明，4 Gy的全身外照射可以导致外周血WBC、RBC、PLT减少，淋巴细胞比例下降，而GSH可以提高受照小鼠外周血细胞数量和淋巴细胞比例;其中100 mg/kg GSH作用最显著，50 mg/kg GSH也有一定程度的作用；然而，200 mg/kg GSH对辐射损伤小鼠外周血象没有明显的改变，甚至引起外周血淋巴细胞比例下降。我们推测200 mg/kg GSH可能减少了电离辐射诱导的细胞周期阻滞，抑制了损伤DNA的修复。对肠损伤研究的结果表明，10 Gy的腹部外照射可导致肠上皮脱落、绒毛变短、腺体萎缩，而GSH可以减轻肠上皮的损伤，保持绒毛结构的完整性;其中100 mg/kg GSH作用最明显，而200 mg/kg的GSH保护作用很小。其原因可能是过高剂量的GSH通过抑制细胞周期延迟影响了损伤DNA的修复，从而减弱了其辐射防护的作用。

综上所述，GSH可以有效减轻急性外照射对造血系统和胃肠道的损伤，对受电离辐射的小鼠具有明显的辐射防护作用，其中100 mg/kg的GSH保护作用最佳。此项研究结果可为GSH作为辐射防护剂进行深入研究提供参考依据，我们将进一步探讨其防护的机制。