琥珀酰化改性菜籽蛋白基复合膜制备及其性能研究

李 扬 章 铖 邹昱成 王 博 鞠兴荣

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心;江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京 210023)

可食性复合膜可适用于食品的内外包装,且在自然环境中可以被降解。该复合膜通过降低食品在储存过程中可能发生的品质变化，延缓一些氧化反应的发生，抑制微生物生长来达到防腐保鲜，延长货架期的目的[1]。目前，可食性复合膜多由蛋白、多糖与脂质组成，这种复合膜以脂质作为阻水组分，蛋白质或多糖作为脂质的支持介质以保持膜的完整性[2]。可食性复合膜的原料主要有淀粉[3]、果胶[4]、壳聚糖[5]、魔芋葡甘聚糖[6]、明胶[7]、海藻酸钠[8]、羟丙基甲基纤维素[9]、大豆蛋白[10]等。这些原料不仅来源广泛，可降解，对环境友好，还可以作为食品风味料和营养强化剂的载体，是近年来科学研究的热点。蛋白类可食性膜营养价值优越，透明度高，分子间交联作用强[11]，机械性能较好。

菜籽蛋白作为可食性膜基料有很多的优点。首先菜籽蛋白营养可食，氨基酸组成平衡，并且蛋白消化率达95%～100%，是一种优质蛋白[12]。我国以及加拿大等地区大面积种植菜籽，菜籽主要作为油料作物，其副产品菜籽粕中蛋白质量分数约35%～40%(干基)[13]，而菜籽粕主要被用作动物饲料或者植物堆肥，造成蛋白资源的极大浪费。开发利用菜籽粕中的蛋白资源，有极大的经济价值和社会意义。此外，菜籽蛋白还具有良好的成膜性[14]，特别是改性后的菜籽蛋白，其机械性能等功能特性得到明显改善。Wang等[15]的研究表明，利用酰化改性菜籽蛋白溶液喷雾干燥形成的微载体壁材的机械强度(450 MPa)显著高于未改性菜籽蛋白微载体(390 MPa)。

HPMC是一种水溶性的纤维素衍生物，具有良好的成膜性[16]。HPMC中含有大量的易形成氢键的羟基[17]，可以与蛋白质分子形成分子间氢键，提高共混膜的机械性能。而其官能团的取代程度，取代类型以及聚合物链的长短都会影响它的溶解性，透水性和机械性能[18]。

本实验将SRPI与HPMC复合制可食性薄膜，通过探讨其最佳制备条件，并对SRPI/HPMC复合膜的机械性能、水蒸气透过性、透明度、二级结构以及微观结构进行研究，以期为开发食品的内层包装提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

双低油菜籽、HPMC(平均摩尔质量为16 000 g/mol，甲氧基取代度为1.9,羟丙基取代度为8.5，黏度η为19 mPa/s)、石油醚(沸程 30～60 ℃)、甘油、吐温20、琥珀酸酐等化学试剂均分析纯。

1.2 方法

1.2.1 菜籽蛋白(RPI)制备

双低菜籽脱壳，粉碎，过筛(60目)，石油醚脱脂8 h，并干燥过筛(40目)，得到脱脂菜籽粕。用蒸馏水按料液比1∶10溶解脱脂菜籽粕，用1 mol/L NaOH调节pH至8.0，离心(4 ℃，8 000 g，20 min)，取上清液用1 mol/L HCl调节pH至4.5，静置1 h，离心(4 ℃，8 000 g，20 min)，得沉淀。取沉淀进行透析(100 ku)，冷冻干燥，得到菜籽蛋白。

1.2.2 琥珀酰化改性菜籽蛋白(SRPI)

取适量菜籽蛋白配制10%(m/V)的菜籽蛋白溶液，用1 mol/L NaOH调节pH至8.0，分次加入10%琥珀酸酐(以蛋白质量计)，用1 mol/L NaOH维持pH=8.0，恒温磁力搅拌(45 ℃)，当pH基本稳定不变，反应完成，经过滤，透析，冷冻干燥，得琥珀酰化改性菜籽蛋白。

1.2.3 琥珀酰化改性菜籽蛋白基复合膜制备

按照表1，取相应质量的RPI，SRPI溶于100 mL馏水中，恒温磁力搅拌(50 ℃，500 r/min，1 h)。HPMC溶液恒温磁力搅拌(90 ℃，500 r/min，1.5 h)。按照表1各成分的配比等体积混合蛋白与HPMC的成膜液并磁力搅拌(90 ℃，500 r/min，0.5 h)，并添加2.0% 的甘油作为增塑剂，1.5%的吐温20 作为乳化剂，使各组分混合均匀。量取制得的各种成膜液25 mL倾倒于聚四氟乙烯平板(PTFE) (10 cm × 10 cm ×1 mm)。在恒温恒湿箱中干燥24 h，成膜(50 ℃，RH=50%)。SRPI∶HPMC=1∶1，SRPI∶HPMC=2 ∶1，SRPI∶HPMC=3∶1，保存以待测量。

表1 不同配比的各成分的成膜液/100 mL

1.2.4 Zeta电位的测定

将样品稀释至0.01%，取少量注入电位池(缓缓注入，防止气泡产生)，放入电位仪中，测试温度为25 ℃，即可测得Zeta电位值。均进样3次，每次重复记录3次，取其平均值。

1.2.5 厚度测定

在SRPI/HPMC复合膜表面随机选取7个点,用电子数显卡尺测量其厚度,取其平均值,用于复合膜机械性能、水蒸气透过性等参数的计算。

1.2.6 透明度测定

将SRPI/HPMC复合膜剪成5 cm×1 cm的矩形长条,贴在玻璃比色皿的一侧，在λ=600 nm下测定吸光度，空白比色皿作对照，重复测定5次。计算公式为：

Opacity=λA

(1)

式中：Opacity为膜的透明度；A为在波长600 nm下测得的吸光度。

1.2.7 傅立叶变换红外测定

取SRPI/HPMC复合膜60 ℃下干燥3 h，在Bruker Tensor 27傅立叶变换红外光谱仪中对其进行检测分析，测试参数为:扫描波长范围800～4 000 cm-1，分变率4 cm-1，扫描次数32 次[20]。曲线去卷积拟合和峰值分布用软件PeakFit(v 4.12 Systat软件有限公司，加利福尼亚)。定量分析蛋白质的二级结构 如表2所示：

表2 酰胺Ⅰ带各峰的指认标准[19]

1.2.8 机械性能测试

根据美国材料试验协会制定的薄型塑料片材拉伸性能的标准测试方法ASTM- D882-02，将薄膜剪切为6 cm×2 cm的长条状,采用TA-XT2i型物性仪测试其抗拉强度TS和伸长率E。初始夹距50 mm,拉伸速度1 mm/s,测试前将样品置于23 ℃，RH=53%恒温恒湿箱内平衡72 h,重复测试5次，取其平均值。抗拉强度和断裂伸长率计算见公式:

(2)

(3)

式中: TS为复合膜的抗拉强度/MPa;F为拉伸最大应力/N;S为拉伸前截面积/mm2;E为复合膜断裂伸长率;L0的原始长度/mm; ΔL膜条断裂时伸长长度/mm。

1.2.9 水蒸气透过性(WVP)

根据GB1037，采用“杯法”测定。用双面胶和石蜡将膜样品密封于内装有8 g无水硫酸铜的小玻璃烧杯杯口，置于装有20 mL的饱和氯化镁溶液的干燥器内168 h,每隔24 h测量1次烧杯的重量，按公式计算水蒸气透过率WVP：

(4)

式中：W为增加的烧杯质量/g;L为膜的平均厚度/mm;t为测量的时间长/168 h;S为杯口的面积/m2;ΔP为式样两侧的水蒸气压差/kPa，25 ℃下为 3.167 1 kPa。

1.2.10 SRPI/HPMC复合膜表面及横截面形态

SRPI/HPMC复合膜表面及横截面形态结构在TM3000型扫描电镜(SEM)下进行观察，膜样品用双面胶固定在铝盘上，表面进行喷金处理，加速电压为15.0 kV，放大倍数为1 000。

2 结果与分析

2.1 成膜液的Zeta电位

Zeta电位的数值与分散系的稳定性有关，反映分散系中颗粒相互排斥与吸引力的大小。Zeta 电位绝对值越高，体系越稳定。从表3中可以看出，所有的溶液的Zeta电位绝对值均大于30，说明溶液都有较好的稳定性。

表3 不同配比的SRPI/HPMC复合膜的厚度和Zeta电位绝对值

注：小写字母不同表示差异显著性 (P<0.05)。

2.2 厚度和透明度

表3测定数据显示，不同配比的SRPI/HPMC复合膜厚度在0.158～0.167 mm之间，与市售保鲜膜厚度相近(约0.10 mm)。食品包装材料的透明度直接影响食品的感官特性。因在碱性条件下制得的RPI膜，颜色略微偏黄，一定程度上影响膜的感官性状，通过与HPMC复合制备的膜的透明度较RPI膜显著提高(P<0.05)。不同复合配比的膜透明度能无明显差异(P>0.05)。从图1可以看出不同配比的SRPI/HPMC复合膜都有良好光学性能，满足食品包装透明可见的要求。

注：小写字母不同表示差异显著性 (P<0.05)。余同。图1 RPI和不同配比的SRPI/HPMC复合膜的透明度

2.3 傅立叶变换红外光谱分析

图2为RPI、SRPI、HPMC、SRPI/HPMC膜在800～4 000 cm-1范围的FT-IR光谱。实验结果表明，与对照组比较不同配比的SRPI/HPMC复合膜3 300 cm-1附近有一个强而宽的吸收峰，是由羟基O—H伸缩振动引起的[20]。在SRPI/HPMC复合膜3 287 cm-1处的吸收峰由分子间氢键O—H和酰胺N—H伸缩振动引起的，1 550 cm-1处是酰胺Ⅱ带(—NH弯曲振动)的吸收峰[21]，1 247 cm-1的吸收是C—N伸缩振动造成的，1 403 cm-1是C—OH振动，2 923、2 867 cm-1处是烷烃C—H伸缩振动引起的较弱的吸收，1 037、945 cm-1是由C—O—C伸缩振动引起的。SRPI/HPMC复合膜的3 460～3 160 cm-1处出现一个较宽的吸收，随着蛋白比例增大，峰值变宽，角度变钝，推测其原因可能是由于蛋白中发生氢键间的缔合作用增多。从红外光谱分析中可以看出,随着菜籽蛋白比例的提高，SRPI/HPMC复合膜特征峰强度明显增强,共混主要表现成膜分子之间的共价键的变化。当两种组分之间的相互作用加强时，表明这两组分相容性较好，为SRPI/HPMC复合膜的制备提供理论基础。从图2中可以看出，与RPI相比，SRPI膜的二级结构中β-折叠与α-螺旋占比增大，无规则卷曲占比减小，α-螺旋是一种相对规则的构象，主要位于蛋白质内部,其中包含大量的容易与其他极性集团发生作用的氢键[22]。β-转角所占面积减小，β-折叠面积增大，发生β-转角向β-折叠的转变，这是由氨基酸残基跟琥珀酸酐反应造成的[23]。不同配比的SRPI/HPMC 复合膜α-螺旋占比无明显变化，无规则卷曲占比减小，而β-转角占比提升，这可能与复合膜的机械性能和阻水性有关。

图2 不同配比的SRPI/HPMC复合膜的红外光谱图

图3 酰胺I带各峰在高斯曲线拟合后峰值所占的面积

2.4 机械性能测试

图4 RPI 和不同配比的SRPI/HPMC共混膜机械性能

拉伸强度(TS)和断裂伸长率(E)是反映膜机械性能的2个主要指标。各实验组机械性能测试结果见图4，实验结果显示，RPI膜拉伸强度值太小(<4.0 MPa)，不能满足食品包装材料的使用要求。SRPI膜与RPI膜相比，拉伸强度提高18.7%，断裂伸长率提高38.7%，SPRPI/HPMC复合膜拉伸强度和断裂伸长率较SRPI都有显著提升(P<0.05)，当SRPI∶HPMC=3∶1时，拉伸强度提高101.3%，说明RPI经琥珀酰化改性后，溶液均一稳定，是形成SRPI/HPMC共混膜良好机械性能的重要基础。此外，不同配比的SRPI/HPMC复合膜机械性能测试结果表明，SRPI比例的增加，制备的SRPI/PMC共混膜拉伸强度显著降低(P<0.05)，膜的断裂伸长率显著增大(P<0.05)。这可能因为单位体积中SRPI聚集的越多，形成的蛋白质分子网络结构将加强分子链间的相互作用，宏观上表现为膜的断裂伸长性能增加。HPMC的结构单元D-吡喃式葡萄糖残基上含有—OCH3(—[OCH2CH—(CH3)]nOH)与未反应的—OH，属活性基团，且支链较长，与SRPI分子上的氨基或酰氨基之间产生了分子间氢键作用，使得膜的内部网络结构增强，从而表现出TS值的增大[24-25]。

2.5 水蒸气透过性

水蒸气透过性(WVP)是一个表征膜重要的性质,其直接反映膜控制水分在食品与外界环境中迁移的能力[26-27]。不同配比的SRPI/HPMC复合膜WVP详见图 5，测定结果显示，RPI膜WVP为0.4 317 ng/(m2·s·Pa)，与之对比，不同配比的SRPI/HPMC复合膜WVP均显著降低(P<0.05)，主要原因是HPMC的结构单元D-吡喃式葡萄糖残基上含有甲氧基(—OCH3)，—OCH3是疏水性基团，HPMC大分子上的羟丙基与蛋白质分子的—NH2和—COO—基团之间形成氢键，形成较为稳定的网络结构，使大量的疏水集团暴露在体系中，从而提高膜的疏水性。当SRPI∶HPMC=3∶1时，复合膜与SRPI膜相比阻水性提高24.1%。可见，SRPI/HPMC复合膜具有更好的阻水性能。

图5 RPI和不同配比的SRPI/HPMC复合膜的透水性

2.6 蛋白基膜的的表面和横截面的微观结构的扫描电镜图

图6反映了不同配比的蛋白基膜的的表面和横截面的微观结构。RPI和HPMC能够形成相对比较光滑的薄膜，无明显不均匀空洞。纯的菜籽蛋白膜(RPI)和琥珀酰化改性的菜籽蛋白(SRPI)表面较为平整，出现细小裂痕，并且有蛋白质结晶，这可能会导致膜的机械性能和阻水性能较差。SRPI∶HPMC=1∶1时，SRPI/HPMC复合膜结构不均匀，出现团块小颗粒(图6C)，当SRPI∶HPMC=3∶1时(如图6E)，膜表面结构变得紧凑、均匀，表明当复合膜中菜籽蛋白含量较高时，与HPMC容易形成结构致密的复合膜。

注：A为RPI;B为SRPI;C为1∶1;D为2∶1;E为3∶1;F为RPI横截面; G为SRPI横截面；H为1∶1横截面; I为2∶1横截面; J为3∶1横截面。图6 不同配比的SRPI/HPMC复合膜表面和横截面的扫描电镜图

3 结论

本实验通过琥珀酰化改性的菜籽蛋白与羟丙基甲基纤维素复合制得可食性薄膜条件的研究，结果表明，SRPI膜与RPI膜相比，拉伸强度、断裂伸长率和透明度都有显著提高，并且蛋白膜的二级结构中无规则卷曲占比减小，微观结构较为紧密。HPMC作为菜籽蛋白的良好的复合材料，在SRPI∶HPMC=3 ∶1时，能显著地改善SRPI膜的机械性能，光学性能以及阻水性能。