高效降解棉籽粕中游离棉酚菌株的筛选及复配发酵方式的优化

亓秀晔 谢全喜 于佳民 赵 倩 张志焱 徐海燕 谷 巍

(山东宝来利来生物工程股份有限公司，泰安 271000)

随着我国畜牧业的快速发展，饲料的需求越来越大。棉籽饼(粕)是我国除豆粕以外的一种优质的植物性蛋白饲料，因此棉籽粕的开发利用是解决我国蛋白质资源短缺的主要途径之一。我国每年可生产600多万t棉籽粕，而使用量仅为30%，资源浪费严重[1]，这是由于棉籽饼中含有棉酚、环丙稀脂肪酸、单宁等有毒物质，制约了其在畜牧业中的应用。其中最主要的是棉酚。棉酚的存在形式有2种，即结合棉酚和游离棉酚。结合棉酚在机体消化系统中不被吸收，可很快随粪便排出体外，毒性很低。游离棉酚分子结构中的活性基团(醛基和羧基)对动物毒性很大，长期饲喂动物过多的未经脱毒的棉籽粕饲料，棉酚含量会在动物体内蓄积，引发中毒，棉酚中毒的表现在所有动物中是相似的，均会导致动物出现急性呼吸窘迫临床症状，厌食乏力，甚至死亡等[2-3]。大量动物实验如羊、猪和肉鸡等表明，棉酚在动物体内各器官中的残留是不均匀的，最先在肝脏中蓄积，其次是胆汁、肾、脾和血液，而淋巴结、心、肺、膈肌和胰中的含量较低[4]。饲料中游离棉酚可以在不同畜禽体内残留，并转移到人们可食用的畜产品中[5]。

棉粕的脱毒方法主要有物理法、化学法和微生物发酵法等，其中微生物发酵法是目前普遍认为的成本低、效果好、较安全的脱毒方法[6-8]。研究表明，微生物发酵能有效降解饲料中的抗营养因子，促进养分的消化吸收，改善动物健康，减少饲用抗生素(促生长)的使用[9]。微生物发酵棉籽饼脱毒的关键是菌种的选择，不同微生物菌种对棉酚的降解能力不同，筛选优良的微生物菌种是影响棉籽粕脱毒效果的首要条件。选取合适的微生物进行饲料的发酵能有效降解饲料中的抗营养因子，促进养分的消化吸收，分泌的代谢产物如小肽、有机酸等利于改善动物健康[10-12]。目前，国内外研究发现可降解棉籽粕中游离棉酚的微生物主要有假丝酵母、黑曲霉、稻根霉菌、鲁氏毛霉甚至还有黄曲霉等真菌、芽孢菌和乳酸菌等细菌。但是这些菌单独发酵时存在一些不足，比如霉菌在动物饲料中使用的安全性仍然被怀疑；芽孢菌在氨基酸代谢中会发生脱羧或脱氨作用，产生刺鼻的氨，影响发酵风味；乳酸菌降解棉酚效果不显著等。实际生产中真菌和细菌对营养物质的利用存在一定的差别，如果利用安全的真菌和细菌联合发酵棉籽粕或许可以更有利于棉籽粕中棉酚的降解。本研究旨在利用酵母菌和乳酸菌对棉籽粕进行固态发酵，以降低棉酚含量，提高棉粕蛋白利用率，改善棉粕品质，具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 发酵基料及菌株

棉籽粕由新疆泰昆生物集团提供，粉碎过40目筛。

酵母菌(Yeast)菌株：BLCC4-0327、BLCC4-0021、BLCC4-0018、BLCC4-0048，乳酸杆菌(Lactobacillus)菌株：BLCC2-0015、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0112和BLCC2-0111；均由山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院保存。

1.1.2 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium，YEPD)培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏0.5 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，pH自然，121 ℃灭菌20 min。

MRS培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏8 g/L，酵母膏4 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸锰0.3 g/L，柠檬酸铵2 g/L，乙酸钠5 g/L，吐温-80 1 mL/L，pH值6.0，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 化学试剂

葡萄糖：山东祥瑞药业有限公司；硫酸镁、硫酸锰：济南汇丰达化工有限公司；柠檬酸铵：上海抚生实业有限公司；乙酸钠：青岛捷世康生物科技有限公司；吐温-80、氢氧化钠、氢氧化钠、磷酸、氯化钠：天津博迪化工股份有限公司；磷酸二氢钾：天津市致远化学试剂有限公司；试剂均为分析纯。乙腈、丙酮、甲醇(均为色谱级)：天津市永大化学试剂有限公司；微孔滤膜(直径13 mm、孔径0.22 μm)：上海安谱有限公司；棉酚标准品(纯度98%)：上海源叶生物科技有限公司。蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；牛肉膏、酵母膏：天津市英博生化试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9082电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒温振荡器：扬州培英实验仪器有限公司；LDE-2A低速离心机：北京时代北利离心机有限公司；SHB-ⅢS循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；RE52CS旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SB1200 超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；LC-20AT液相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌和乳杆菌发酵液的制备

将4 ℃条件下保存的酵母斜面活化，转接到装有50 mL YEPD培养基的三角瓶中，30 ℃摇床振荡培养16 h备用；将4 ℃条件下保存的乳杆菌斜面活化，转接到装有100 mL MRS培养基的盐水瓶中，37 ℃培养箱静置培养24 h备用。

1.3.2 实验设计

1.3.2.1 酵母菌的筛选

称取一定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比为1∶0.4 (m/V)，装量50 g/瓶，按2%接种量分别接入培养好的酵母菌种子液，每个样品设3个平行，以不接种任何菌株的空白料为对照，置于30 ℃培养箱进行需氧发酵，分别于发酵24 h和48 h取样，测定活菌数、酸溶蛋白和游离棉酚含量。

1.3.2.2 乳杆菌的筛选

称取一定量的基料按料水比1∶0.4 (g∶mL)配制好，以袋量为100 g/袋装袋，每个样品设3个平行，分别按照2%接种量接入培养好的乳杆菌发酵液，以不接种任何菌株的空白料为对照，压实后于37 ℃培养箱进行生料厌氧发酵，分别于发酵24 h和48 h取样，测定pH值、活菌数、酸溶蛋白和游离棉酚含量。

1.3.2.3 混菌发酵

将筛选得到的酵母菌和乳杆菌进行混菌发酵，发酵方式为厌氧发酵，料水比为1∶0.4(g ∶mL)，以装袋量为100 g/袋装袋，接种量2%，乳杆菌∶酵母菌(3∶2)，生料发酵，30 ℃培养箱培养。以不接种任何菌株的空白料为对照，分别于发酵24 h和48 h取样，测定pH值、活菌数、酸溶蛋白和游离棉酚含量。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 pH测定

取10 g样品加入90 mL灭菌后的生理盐水中，搅拌均匀后直接测定。

1.4.2 乳杆菌和酵母菌活菌数的测定

准确称取发酵棉粕10.0 g，用生理盐水10倍递增稀释，取适当稀释度的样品分别至LBS培养基和孟加拉红培养基中，分别于37 ℃和30 ℃培养48 h，根据菌落数计算样品中乳杆菌和酵母菌数量，结果用CFU/g表示。

1.4.3 酸溶蛋白含量的测定

准确称取2.00 g发酵棉籽粕于25 mL具塞试管中，加入15%三氯乙酸溶液10 mL，混合均匀，静止5 min，定容至25 mL，每隔2 min混匀1次，共计时30 min。将溶液定量转移，抽滤，取滤液10 mL，转入消化管中，加入3 g混合催化剂(硫酸钾∶无水硫酸铜=15 ∶1)，与滤液混合均匀，再加入7～8 mL浓硫酸，将消化管置于消化炉中420 ℃消化，待消化液呈透亮的蓝绿色时，继续消化40 min，按照凯氏定氮法测定上清液中可溶性蛋白质含量。另准确称取2.00 g发酵棉籽粕，采用凯氏定氮法测定样品中粗蛋白含量。

酸溶蛋白含量=(上清液中可溶性蛋白质含量×25/10)/样品中粗蛋白含量×100%。

1.4.4 游离棉酚含量的测定[13]

棉酚标准溶液的配制：准确称取棉酚标准品，用乙腈- 0.2%磷酸(体积比为85∶15)溶解得1.21 mg/mL的标准品储备液，标准储备液再用乙腈-0.2%磷酸(体积比为85∶15)稀释成121 μg/mL的标准品工作液。用流动相将标准品工作液逐级稀释得到浓度分别为61.50、20.17、5.04、2.52、1.21 μg/mL的标准工作液，浓度由低至高进样测定，以峰面积和浓度作图，得到标准曲线回归方程为：Y=0.000 005 45X+ 0.160 525(R2=0.999 965 2)，线性范围为1.21～121 μg/mL。参照GB 5009.148—2014规定利用高效液相色谱法检测[14]，植物油体样品取样1.0 g 时，检出限为2.5 mg/kg ，定量限为7.5 mg/kg；以棉籽饼为原料的水溶性液体样品取样10 g 时，检出限为0.25 mg/kg，定量限为0.75 mg/kg。

待测样品游离棉酚的提取：准确称取待测样品3.00 g，加入丙酮30 mL，超声提取30 min，25 ℃下3 000 r/min离心10 min，重复提取3次，合并上清液。将上清液全部转移至蒸发瓶中，旋转蒸发至干，用乙腈- 0.2%磷酸(体积比为85∶15)溶液溶解，多次超声清洗转移至25 mL容量瓶，定容，过0.22 μm滤膜后供HPLC测定。

HPLC法测定游离棉酚含量：色谱条件为色谱柱IntertsilR ODS-2(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈- 0.2%磷酸(体积比为85∶15)溶液，流速1.0 mL/min，紫外检测波长235 nm，进样量20 μL，柱温25℃。

1.4.5 棉酚标准曲线的绘制

由棉酚标准品的HPLC色谱图(图1，棉酚标准品质量浓度6.15 μg/mL)，可以看出，在5.686 min左右出棉酚色谱峰，且稳定性良好、分离效果好、峰型理想、灵敏度高。由图2可以看出，棉酚标准曲线线性吻合良好、定量范围广、定量限低、准确度和灵敏度高，该方法可用于准确测定游离棉酚的含量。

图1 棉酚标准品的HPLC色谱图

图2 游离棉酚的标准曲线

1.5 数据分析

数据用Excel 2007进行初步处理后，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)程序进行方差分析，LSD法进行组间多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与讨论

2.1 酵母菌的筛选

由表1可知，发酵24 h时，各酵母菌菌株均能够成功发酵棉籽粕，各组发酵棉籽粕中酵母菌活菌数均在几亿水平，差异不显著；与空白对照组相比，各菌株发酵均显著提高了发酵棉籽粕中酸溶蛋白含量(P<0.05)，其中以菌株BLCC4-0327发酵时最高，四组酵母菌发酵组间差异不显著(P>0.05)，BLCC4-0327组的酸溶蛋白含量较空白对照组高出23.20%。以BLCC4-0327组发酵棉籽粕游离棉酚含量最低，显著低于其他各组(P<0.05)，其游离棉酚降解率达到72.72%，其次是BLCC4-0018组，BLCC4-0048组游离棉酚降解率最低。

表1 不同酵母菌发酵棉粕对饲料品质的影响

注：游离棉酚降解率=[(空白对照组样品游离棉酚含量-发酵组样品游离棉酚含量)/空白对照组样品游离棉酚含量]×100，余同。

发酵48 h时，各组发酵棉籽粕中酵母菌活菌数升高，以BLCC4-0327较高，但差异不显著。BLCC4-0327组的酸溶蛋白含量最高，显著高于高于其他酵母菌发酵组(P<0.05)。以BLCC4-0327组发酵棉籽粕游离棉酚含量最低，显著低于其他各组(P<0.05)，其游离棉酚降解率达到81.83%，其次是BLCC4-0018组，BLCC4-0048组游离棉酚降解率最低。综上可知，酵母菌BLCC4-0327在提高发酵棉籽粕的酸溶蛋白含量和降低游离棉酚含量方面效果最好。

2.2 乳酸菌的筛选

由表2可知，5个乳酸菌发酵组中，发酵24 h时除BLCC2-0112组发酵棉籽粕中乳酸菌活菌数较低外，其他乳酸菌发酵组间差异不显著(P>0.05)，均在几十亿水平，发酵48 h 时仍以BLCC2-0112组发酵棉籽粕中乳酸菌活菌数最低，显著低于其他乳酸菌发酵组(P<0.05)；无论是发酵24 h还是发酵48 h时，发酵棉籽粕的pH均以BLCC2-0092和BLCC2-0001组最低，其次是BLCC2-0015组，这3组在发酵48 h时pH均降至5.00以下，其中BLCC2-0092组在发酵48 h时pH降至4.67。从降低发酵棉籽粕的pH来看，5株乳酸菌中以菌株BLCC2-0092、BLCC2-0001和BLCC2-0015发酵棉籽粕较好，最优为菌株BLCC2-0092。

表2 乳酸菌发酵对棉粕品质和游离棉酚含量的影响

表3 酵母菌和乳酸菌复配发酵对饲料品质的影响

2.3 酵母菌和乳酸菌的复配发酵

由表3可以看出，各复配菌株发酵组各发酵阶段发酵棉籽粕中酵母菌活菌数均达到或接近亿水平，乳酸菌活菌数达到几十亿水平，与同时间段下菌株单独发酵时相比有所降低。综合各项指标来看，2个复配菌株发酵组中以BLCC4-0327+ BLCC2-0092组最优。与空白对照组相比，BLCC4-0327+ BLCC2-0092组各发酵阶段的发酵棉籽粕的pH均显著降低(P<0.05)，发酵24 h时pH降至5.73，发酵48 h时pH降至5.64，这高于乳酸菌单独发酵时的pH，但显著低于酵母菌单独发酵时(数值未列出，酵母菌发酵pH变化不大，均在6.50以上)。各复配菌株发酵组各发酵阶段发酵棉籽粕的游离棉酚含量显著降低(P<0.05)，游离棉酚降解率均在60%以上，优于乳酸菌单独发酵时。发酵24 h时，BLCC4-0327+BLCC2-0092组游离棉酚降解率达到70.99%，发酵48 h时游离棉酚降解率达到73.44%，这个数值稍低于酵母菌BLCC4-0327单独发酵时。

各复配菌株发酵组发酵棉籽粕的酸溶蛋白含量显著提高，发酵24 h时BLCC4-0327+ BLCC2-0092组酸溶蛋白质量分数达到14.61%，这比BLCC4-0327单独发酵时提高了82.17%，比BLCC2-0092单独发酵时提高了122.71%；发酵48 h时酸溶蛋白质量分数达到17.61%，这比BLCC4-0327单独发酵时提高了111.91%，比BLCC2-0092单独发酵时提高了176.45%。

3 讨论

利用微生物发酵棉籽粕，在使其游离棉酚含量的安全性大大提高的同时，还可以提高棉籽粕的营养价值如改善蛋白质含量及发酵风味等，增加其在动物饲粮中的添加量，提高棉籽粕的利用率[15-16]。发酵、酶解粕类和植物蛋白质源的主要目的是将其中的大分子蛋白质降解成为小分子蛋白质，甚至降解成多肽和小肽，从而促进蛋白质的合成，促进矿物质元素的吸收利用，提高动物机体的免疫机能以及动物的生长速率和生产性能。研究表明，使用酸溶蛋白质含量指标评价发酵、酶解粕类蛋白质品质，既可以反映其中抗原蛋白质和其他蛋白质抗营养因子被水解的程度，进而揭示该类抗营养因子活性被消除的程度，又可在一定程度上反映肽含量的高低[17-18]。

酵母菌是人类利用较早的一大类真核微生物，它是研究真核生物的模式菌株；此外，酵母菌还具有脱毒作用，主要表现在两个方面：一方面是酵母菌对真菌毒素、细菌内毒素及其他有害有毒物质具有减毒或脱毒作用；另一方面为酵母菌细胞壁中的β-葡聚糖及糖蛋白参与了生物脱毒过程，酵母菌细胞壁也作为高效脱毒剂得到了应用[19]。有关酵母菌发酵棉籽粕脱毒效果的研究有很多，但大都需要较复杂的条件，或是需要较大的接种量或是培养基需要另添加底物。如程福亮等[20]以产朊假丝酵母为发酵菌种，在温度为30 ℃、发酵底物含水量为37%和接种量5%的条件下进行固态厌氧发酵，发酵36 h 降解棉酚率为85.7%；周慧林等[21]对酿酒酵母、产朊假丝酵母和热带假丝酵母3种酵母棉酚的培养基上的生长能力进行了比较，发现产朊假丝酵母降解棉酚能力强，在接种107水平，30 ℃发酵24 h时棉酚含量下降了55.6%。陈生琴等[22]发现以醋酸棉酚为唯一碳源，分离筛选到的一株高效降解棉酚菌株RE-1，在最优发酵条件为温度34 ℃、时间8 d、pH5.0、料水比1∶0.5、接种量20%时，发酵棉籽粕中棉酚的降解率达到72.54%；张文举等[23]发现，在棉籽饼发酵底物中需要额外补充糖类、尿素或是硫酸亚铁等，才可以降低发酵料的棉酚含量。在本研究中，酵母菌BLCC4-0327单独发酵棉籽粕，2%接种量，30 ℃发酵24 h时，游离棉酚降解率可达到72.72%，同时发酵料的酸溶蛋白含量较空白对照组提高23.02%(P<0.05)，优于文献中报道。

乳酸菌在发酵过程中产生乳酸、乙酸、丙酸和细菌素等多种物质，这些物质除具有杀毒抑菌作用外，还具有维持肠道内菌群平衡、抑制病原菌微生物生长、调节胃肠道功能等作用，同时饼粕类饲料经乳酸菌发酵后，有特殊的酸甜芳香气味，pH下降，能有效改善饲料的适口性[24]。刘建成等[25]研究发现一株德氏乳杆菌固态发酵棉粕产有机酸含量达到25.64 g/kg，比优化前提高了39.65%；乳酸菌固态发酵酶解豆粕、棉籽粕和菜籽粕均能有效提高粗蛋白质含量，降低pH，使酸度增加；有效降解棉籽粕中单宁及菜籽中异硫氰酸酯和唑烷硫酮，而对游离棉酚及植酸的降解能力有限[26]。这也与本研究结果一致，本研究发现几株乳酸菌均不具有降解棉酚的能力，但可以降低发酵棉籽粕的pH，乳酸菌BLCC2-0092发酵24 h时，发酵棉籽粕 pH 降至5.47。因此，本研究利用酵母菌和乳酸菌复配发酵棉籽粕，在降低发酵棉籽粕中游离棉酚含量的同时，改善发酵风味，大幅度提高饲料营养价值。

混菌发酵的效果优于单菌发酵。诸葛斌等[27]利用黑曲霉P1和枯草芽孢杆菌H1按照2∶1比例混菌发酵，发酵后棉粕小肽含量可提高18.36%；乔晓艳等[28]利用热带假丝酵母JD-9和甘酪乳杆菌MX-48发酵棉粕，发酵后游离棉酚脱毒率达到48.1%，棉粕中小肽含量提高14.43%；刘惠琴等[29]从棉籽壳中分离出一株能降解游离棉酚的细菌M2，产朊假丝酵母与M2 的混合接种比为7∶3，发酵温度32.5 ℃，发酵时间54 h，底物初始含水量75%，pH自然，在此条件下游离棉酚的降解率最高，达到53.021%。本研究中，将降解游离棉酚效果最好的酵母菌和降低 pH 效果最好的乳酸菌复配发酵，与空白对照组相比，最优复配发酵组(BLCC4-0327+ BLCC2-0092组)各发酵阶段的发酵棉籽粕的pH均显著降低(P<0.05)，发酵24 h时pH降至5.73；游离棉酚含量显著降低(P<0.05)，发酵24 h时游离棉酚降解率达到70.99%，发酵48 h时游离棉酚降解率达到73.44%，但这两个指标并没有超越乳酸菌和酵母菌单独发酵时的效果。分析原因可能是由于接种比例问题，在发酵过程中导致两种菌生长状态不一致[30]，酵母菌生长旺盛会抑制产酸，导致pH降低没那么明显；产酸量过高会抑制酵母菌生长，而酵母菌是降解游离棉酚的有效菌株，从而导致混菌发酵的游离棉酚降解率没有酵母菌单独发酵时高，但总体差异不显著。整体来看，混菌发酵优于单菌，主要体现在酸溶蛋白方面：最优复配发酵组(BLCC4-0327+BLCC2-0092组)发酵24 h时BLCC4-0327+ BLCC2-0092组酸溶蛋白质量分数达到14.61%，这比BLCC4-0327单独发酵时提高了82.17%，比BLCC2-0092单独发酵时提高了122.71%；发酵48 h时酸溶蛋白质量分数达到17.61%，这比BLCC4-0327单独发酵时提高了111.91%，比BLCC2-0092单独发酵时提高了176.45%。

4 结论

利用酵母菌和乳酸菌发酵棉籽粕，筛选出可高效降解游离棉酚的酵母菌BLCC4-0327，可改善发酵风味的乳酸菌BLCC2-0092。结果表明，最优复配发酵组为BLCC4-0327+BLCC2-0092(1∶1)，30 ℃厌氧发酵。与空白对照组相比，最优复配发酵组各发酵阶段的发酵棉籽粕的pH均显著降低(P<0.05)；酸溶蛋白含量显著提高(P<0.05)；游离棉酚含量显著降低(P<0.05)。