SRCIN1基因表达对肺癌细胞生长及替莫唑胺化疗敏感性的影响

马琴 杨磊 刘喜婷

(甘肃省肿瘤医院呼吸科，甘肃 兰州 730050)

肺癌具有高转移及侵袭能力，近些年其发病率呈上升趋势〔1〕。肿瘤的发生发展是一个多步骤、多环节、多基因的复杂过程，涉及抑癌基因失活、癌基因激活等，因此，使失活的抑癌基因重新获得活性，对于肿瘤治疗具有重要意义。SRC激酶信号抑制剂(SRCIN)1又称为p140CAP，定位于17q21.1染色体，以往研究表明，SRCIN1在内瘤基因(Src)失活中起重要作用，在肿瘤中起着抑癌基因的作用〔2，3〕。多种肿瘤中SRCIN1呈现低表达，如胃癌、肺癌等〔4，5〕，其表达可促进肿瘤发展。过表达SRCIN1对肿瘤生长有抑制作用，如可抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力〔6〕。肺癌中SRCIN1表达下调可促进肺癌细胞增殖，而上调SRCIN1表达可抑制肺癌细胞的增殖和迁移能力〔7〕，但SRCIN1对肺癌细胞侵袭和凋亡的影响及机制研究尚未明确。替莫唑胺是新一代口服烷化剂，可广泛应用于肺癌的治疗。研究发现，替莫唑胺单独使用可明显延长肺癌患者生存期，化疗敏感性增加〔8〕；替莫唑胺可抑制肺癌细胞活力，阻滞细胞周期〔9〕。本研究旨在探讨SRCIN1基因表达对肺癌细胞生长及替莫唑胺化疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂和仪器 肺癌A549细胞购自美国ATCC。替莫唑胺购自中国食品药品检定研究所(批号：100639-201302，纯度为99.6%)；DMEM培养液、胎牛血清(FBS)均购自美国Gibco；噻唑蓝(MTT)试剂盒购自美国Sigma；Transwell小室购自美国Costar；Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒购自南京凯基；增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、B细胞淋巴瘤(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)和β-catenin抗体均购自美国CST；流式细胞仪购自美国BD；酶标仪购自美国Bio Tek公司。

1.2细胞培养及转染 A549细胞用含10%FBS的DMEM培养基，于体积分数为5%的CO2、饱和湿度条件下37℃常规传代培养。实验为生长至对数期的细胞。转染前24 h，以2×105个/ml细胞接种 A549细胞于6孔板，每孔2 ml，观察细胞的生长状态，细胞达80%～90%生长汇合度时，将空质粒(pcDNA3.1)和重组质粒(pcDNA3.1-SRCIN1)转染细胞，未转染的细胞作为空白对照组，转染参照脂质体LipofectamineTM2000说明。转染48 h，收集细胞用于转染效果检测。

1.3MTT实验 A549细胞分成空白对照组、pcDNA3.1-SRCIN1组、替莫唑胺(200 μmol/L替莫唑胺处理细胞)组和pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺组。以5×103个/孔接种 A549细胞于96孔板，常规培养24 h至细胞贴壁，按照上述分组处理细胞，每组设置5个复孔，48 h后收集细胞，每孔中加入20 μl的MTT液，培养4 h后加150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，酶标仪测定490 nm(吸光度值A值)。实验重复3次。

1.4Transwell实验 将按照1.3分组处理后的4组A549细胞重悬于无血清培养液中，并将细胞浓度调整为1×105个/ml，加入已涂有Matrigel胶的 Transwell小室的上层，小室的下层加入DMEM培养液500 μl，每组3个复孔，12 h后终止实验，将小室取出，4%的多聚甲醛固定20 min，0.1%的结晶紫染色20 min，棉签轻拭掉上膜面未穿过膜的细胞，400倍光学显微镜下，随机选择5个视野，计算在每个视野下穿过膜的细胞数量，取均值。实验重复3次。

1.5细胞凋亡实验 胰酶消化按照上述方法处理48 h的细胞，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，1×结合缓冲液重悬细胞，并将细胞密度调整为1×106个/ml，取500 μl的单细胞悬液，加Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl，冰块上避光孵育15～20 min，上机前加1×结合缓冲液400 μl，1 h内通过流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.6Western印迹法 PBS洗涤按照上述方法处理48 h的细胞，适量放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白，每孔道上样40 μg裂解蛋白，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，分离后的蛋白经电转移至硝酸纤维素(NC)膜，5%脱脂奶粉封闭膜1 h，加一抗，即皆按照1∶1 000稀释的PCNA、MMP-2、Bax和β-catenin抗体，以GAPDH作为内参，4℃孵育过夜，次日，洗膜，加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，37℃孵育1 h，洗膜，加电化学发光(ECL)发光液，凝胶成像系统进行结果观察。以目的蛋白和GAPDH蛋白灰度值比值作为各蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1转染pcDNA3.1-SRCIN1的A549细胞SRCIN1的蛋白表达 pcDNA3.1-SRCIN1组细胞SRCIN1的蛋白相对表达量(0.611±0.058)显著高于空白对照组(0.072±0.009,P<0.05)，pcDNA3.1组SRCIN1的蛋白相对表达量(0.086±0.010)与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3组差异显著(F=239.637，P=0.000)。见图1。

图1 3组A549细胞SRCIN1的蛋白表达

2.2各组A549细胞活力检测 pcDNA3.1-SRCIN1组细胞活力(0.546±0.047)和替莫唑胺组细胞活力(0.502±0.042)均显著低于空白对照组(0.872±0.069，P<0.05)，而pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺组细胞活力(0.329±0.034)明显低于pcDNA3.1-SRCIN1组和替莫唑胺组(P<0.05)。4组差异显著(F=62.384，P=0.000)。

2.3各组A549细胞侵袭能力 pcDNA3.1-SRCIN1组〔(145.3±5.1)个〕和替莫唑胺组穿膜细胞数〔(130.1±4.5)个〕均显著低于空白对照组〔(172.6±7.4)个〕，高于pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺组〔(92.2±3.7)个，P<0.05〕。

2.4各组A549细胞凋亡 pcDNA3.1-SRCIN1组细胞凋亡率〔(20.85±1.63)%〕和替莫唑胺组细胞凋亡率〔(27.31±2.04)%〕均显著高于空白对照组〔(4.56±0.32)%〕，而pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺组细胞凋亡率〔(38.82±4.53)%〕显著高于pcDNA3.1-SRCIN1组和替莫唑胺组(P<0.05)。4组差异显著(F=89.419，P=0.000)。见图2。

图2 各组A549细胞凋亡

2.5各组A549细胞Wnt信号通路下游增殖、侵袭、凋亡相关的PCNA、MMP-2、Bax及β-catenin的蛋白表达 pcDNA3.1-SRCIN1组和替莫唑胺组PCNA、MMP-2和β-catenin的蛋白表达均显著低于空白对照组，Bax蛋白表达显著高于空白对照组(均P<0.05)；pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺组PCNA、MMP-2和β-catenin的蛋白表达均显著低于pcDNA3.1-SRCIN1组和替莫唑胺组，Bax蛋白表达显著高于pcDNA3.1-SRCIN1组和替莫唑胺组(均P<0.05)。见图3和表1。

A：空白对照组；B：pcDNA3.1-SRCIN1组；C：替莫唑胺组；D：pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺组图3 各组A549细胞Wnt信号通路相关蛋白表达

组别β-cateninPCNAMMP-2Bax空白对照组0.768±0.0650.524±0.0460.222±0.0210.067±0.008pcDNA3.1-SRCIN1组0.358±0.0381)2)0.238±0.0251)2)0.118±0.0141)2)0.152±0.0161)2)替莫唑胺组0.211±0.0221)2)0.203±0.0181)2)0.106±0.0121)2)0.183±0.0201)2)pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺组0.106±0.0100.057±0.0080.041±0.0070.355±0.036F/P值161.959/0.000146.446/0.00081.122/0.00086.994/0.000

与空白对照组比较：1)P<0.05；与pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺组：2)P<0.05

3 讨 论

肺癌的发生发展与癌基因表达升高、抑癌基因表达缺失或降低等变化密切相关，且一些基因会随着肺癌恶性程度变化而变化〔10〕，提示分子靶向治疗是肺癌治疗的一个有效途径。SRCIN1基因与肿瘤的发生发展密切相关，如乳腺癌中SRCIN1表达与预后不良呈正相关〔3〕；SRCIN1过表达可逆转由miR-20a引起的多发性骨髓瘤细胞增殖〔11〕。肺癌细胞SRCIN1表达下调，沉默SRCIN1表达均可促进细胞增殖〔5〕。研究指出，上调SRCIN1表达可抑制肺癌细胞的增殖和迁移能力〔7〕。本研究提示SRCIN1过表达对肺癌细胞生长具有抑制作用。替莫唑胺为常见的化疗药物，与多种肿瘤的发生发展密切相关，如肝癌、胶质瘤等〔12，13〕，且有多项研究发现一些基因表达可增加化疗药物的化疗敏感性，如靶向沉默Wip1基因可以显著增加替莫唑胺对胶质瘤细胞增殖的抑制作用〔14〕。miR-346可靶向SRCIN1促进乳腺癌细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力，降低细胞凋亡及多西紫杉醇敏感性〔15〕。SRCIN1过表达是否可增加替莫唑胺化疗敏感性还未明确。本文结果提示SRCIN1过表达可增加替莫唑胺化疗敏感性。

Wnt信号是一种细胞间的分泌蛋白，在进化上极为保守，参与细胞的增殖、凋亡、发育等过程，其异常激活可引起细胞增殖和分化异常，进而导致肿瘤的发生〔16〕。β-catenin为Wnt信号的关键分子，通过与细胞膜上的钙黏蛋白和细胞骨架结合发挥细胞结构维持及黏附作用，β-catenin异常堆积与肺癌的多种临床病理特征密切相关〔17〕。PCNA是一种细胞核蛋白，与DNA的复制密切相关，可调节细胞由G1期向S期过程，其表达高低可衡量肿瘤恶性程度及预后，因此目前已作为肿瘤细胞增殖活性检测的指标〔18〕。肿瘤细胞浸润转移的基本步骤是降解和破坏血管基膜及细胞外基质，MMPs是一组重要的蛋白酶，可降低细胞外基质核基底膜，肿瘤细胞分泌MMPs的能力与细胞的侵袭能力呈正相关。MMP-2高表达可促进包括肺癌在内的多种肿瘤侵袭和迁移能力〔19，20〕。Bax为促凋亡蛋白，属于Bcl-2家族成员，上调表达可诱导肿瘤细胞凋亡〔21〕。本研究提示SRCIN1过表达和替莫唑胺可通过下调Wnt信号抑制肺癌细胞生长。