系统性硬化症相关肺动脉高压兔的目征微循环改变

李倩雨 郭春燕 骆毅 李雪飞 吴锐

(南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330006)

肺动脉高压(PAH)是一种慢性进展性疾病，其预后大多不良，严重者可导致死亡。根据病因，可以将PAH分为原发性和继发性，而结缔组织病相关性肺动脉高压(CTD-PAH)是继发性PAH中的一种，常见的包括系统性红斑狼疮相关PAH、系统性硬化症(SSc)相关PAH和混合性CTD相关PAH。研究显示其中SSc-PAH是CTD-PAH中脑利钠肽(BNP)水平最高、肺弥散功能最差、生存率最低的一组，SSc-PAH患者在未经过治疗的情况下，其平均生存时间为1年，与原发性PAH相比，其死亡风险增加了3倍〔1～4〕。同时，循证医学证据表明改善PAH预后的关键在于早期发现、早期治疗〔5〕。目征微循环是基于中医目诊及目征微循环理论提出的一种血瘀证或血栓前状态的定量诊断技术，主要观察内容为球结膜微血管改变，也是全身微循环的一部分。本研究旨通过观察SSc-PAH兔模型的目征微循环变化特点，为其作为早期预测SSc-PAH的手段提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 健康雄性新西兰幼兔30只，体重1.5～2.0 kg，实验动物由南昌大学医学院动物实验中心提供，于实验前1 w购入实验动物，饲以兔饲料，自由摄入水分，监测实验动物的体重变化，实验过程严格遵循单位及国家实验动物保护与使用的准则。

1.2方法

1.2.1动物分组与处理 将实验动物按体重随机分为3组，每组10只，A组为溶剂对照组，采用无水乙醇与生理盐水2∶8比例混合单次腹腔注射，B组为造模组，采用上述溶剂配成的博来霉素(1 mg/ml)100 μl/d及1.0%野百合碱溶液以50 mg/kg的剂量单次腹腔注射，C组为激素组，在造模同时每晨以甲泼尼龙3.27 mg·kg-1·d-1剂量腹腔注射。各组均饲养3 w造模3 w后观察各组兔目征微循环变化。

1.2.2主要试剂与仪器 目征微循环仪加装血瘀证目征软件(徐州医学光电公司)；电子天平(舜宇恒平仪器)；快速混匀器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；兔固定器(重庆渝科实验耗材)；博来霉素(Invitrogen R250-01)；野百合碱(invitrogen)；甲泼尼龙(Pfizer制药)。

1.2.3肺动脉压力 造模3 w后，以10%的水合氯醛5 ml/kg腹腔内注射麻醉，麻醉后，取仰卧位固定于手术台上，前正中切口，切开皮肤、皮下组织及肌肉组织，沿胸骨左侧第7肋间剪开肌层，近胸骨处向上剪断肋骨，取下胸骨，并在两侧缝线牵拉开，暴露心包，于肺主动脉干前壁插入测压管，监护仪可见肺动脉压力波形，待波形稳定后记录数据，以肺动脉压力上升超过30 mmHg作为PAH造模成功。

1.2.4肺及肺动脉干、皮肤病理 待肺动脉压力检测完后，取下肺动脉干及右肺上叶组织，将其置于10%的甲醛溶液中固定，同时以注射博来霉素的部位为中心减去毛发，观察皮肤的变化，在处死后剪下皮肤组织，同样置于10%的甲醛溶液中固定，将肺动脉干、右肺上叶及皮肤脱水、石蜡包埋、 切片、HE染色以制作病理标本。

1.2.5右室肥厚指数(RVHI) 取出心脏，减去左右心房，清理周围血管及结缔组织，沿室间隔边缘剪下右心室游离壁，分离右心室(RV)、左心室(LV)加室间隔(IVS)，在生理盐水中荡涤残留的血块，清洗干净后用滤纸吸干、称重，并计算RVHI。

1.2.6目征微循环观察方法及评分标准

1.2.6.1观察方法 于造模前、造模成功后第3周的分别对溶剂对照组、造模组和激素组进行检测，采用目征微循环仪器改装成目征诊断仪(586 型号以上电脑，Windows XP 操作平台、加装视频卡、 摄像头和显微镜头，安装目征定量诊断软件)。具体操作： 启动目征诊断软件，将兔的编号、分组、体重等信息输入电脑后，将兔在清醒的状态下固定于兔固定器内，暴露双耳及头部，剪去双眼的眼睑睫毛，用眼科开睑器将上下眼睑撑开，充分暴露出球结膜血管，用高压汞灯以45°的角度斜照于球结膜血管部，调整显微镜观察目征微循环状态，调节摄像头，使电脑显示器上同步出现其观察图像，并将图像及资料录入电脑，其分序号存档，应用目征微循环诊断法进行诊断。

1.2.6.2评分标准 依据李国贤教授〔6〕提出的目征微循环诊断方法，根据血管扭曲条数、增粗条数、血管瘤、网状畸形、新鲜出血、陈旧性出血、报伤点、血管色调，并结合眼周皮肤色调进行积分判断血瘀证及其轻重。

1.3统计学处理 采用 SPSS22.0软件进行t检验及U秩和检验。

2 结 果

2.1肺动脉压力 造模3 w后，存活兔25只，死亡5只，其中溶剂对照组1只，造模组2只，激素组2只。检测各组肺动脉压力平均值(mmHg)：溶剂对照组(15.89±2.02)，造模组(38.13±3.14)，激素组(24.5±4.4),3组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，并且造模组均达到30 mmHg以上。

2.2肺及肺动脉干、皮肤病理 造模3 w后肺动脉干、右肺上叶、皮肤病理切片HE染色可见造模组与激素组肺动脉干的内膜和中膜明显较溶剂对照组增厚，其中以造模组增厚最为明显；造模组与激素组的右肺上叶小动脉管壁较溶剂对照组也明显增厚，管腔狭窄，并伴有肺组织的瘀血，且造模组的小动脉管壁厚度比激素组的增厚更加明显，按照Rabinovitch等〔7〕对PAH进行的病理分级，可以发现激素组的肺组织病理分级多在一期，而造模组多处于二、三期，见图1。在皮肤病理方面，相较于溶剂对照组，造模组的皮肤真皮和皮下组织胶原纤维增生明显，真皮层增厚，胶原肿胀、纤维化，弹性纤维破坏，表皮、皮肤附属器及皮脂腺萎缩，汗腺减少。 造模组的病理符合SSC-PAH的表现，见图1。

2.3RVHI 溶剂对照组为(0.253±0.008)，造模组为(0.377±0.006)，激素组为(0.311±0.027)，3组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4兔目征微循环改变

2.4.1兔目征微循环总计分改变 根据“目征微循环诊断方法”计算得出目征积分，造模3 w后，计算各组总积分值：溶剂对照组(1.67±2.50)分、造模组(11.25±5.18)分、激素组(5.63±3.20)分，3组之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4.23组亚型目征微循环观察指标积分比较 在网状畸形、血管瘤或血管怒张方面，造模组与溶剂对照对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而激素组与造模组、激素组与溶剂对照组间各亚型的比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

图1 各组肺组织皮肤组织病理结果(HE，×100)

组别n血管增粗血管扭曲报伤点网状畸形出血血管瘤或血管怒张血管色调溶剂对照组91.11±2.200.56±1.670.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00造模组81.88±2.591.86±3.720.00±0.003.13±4.581)0.00±0.003.13±4.581)1.25±2.31激素组81.25±2.311.25±2.310.00±0.001.86±3.720.00±0.001.25±2.310.00±0.00

与溶剂对照组比较：1)P<0.05

2.4.33组亚型目征形态学改变 造模3 w后，造模组及激素组均可见微血管通透性增高，血管边缘模糊。造模组还可见血管增粗、血管扭曲、网状畸形、血管瘤及血管色调改变，激素组可见血管增粗、血管扭曲、网状畸形及血管瘤样改变(图2)。

A、B、C为溶剂对照组：正常球结膜微血管形态，未见畸形、出血、扩张；D、E、F为激素组：D可见部分血管怒张，E可见部分血管增粗，F可见部分血管扭曲；G、H、I为造模组：G可见部分血管扭曲，H可见部分血管色调改变，I可见部分血管瘤样改变图2 各组亚型目征形态学改变

3 讨 论

SSc是一种复杂的自身免疫性疾病，微血管内皮细胞和小血管的纤维增生性病变是其发病机制之一〔8〕。PAH作为SSc最严重的并发症之一，其发生与SSc的微循环血管阻力增加有密切关系〔9〕。 2013年Valeria等〔10〕的研究发现在SSc的患者中甲襞微循环的评分高低与PAH的发生有关，强调了微循环的评估在SSc-PAH中的重要性。 目征微循环相较于甲襞微循环检测更加不容易受外界环境影响，而且其可肉眼直接观察进行，方便快捷，属于无创检查。既往的研究已经探讨了高血压、糖尿病、慢性乙肝肝炎及系统性红斑狼疮血栓前状态与目征的关系〔11～14〕，发现目征可作为提示2型糖尿病慢性并发症发生的体征之一、高血压控制达标及预测靶器官损伤的指标及判断慢性乙型肝炎血瘀证轻重的有效方法。并且研究发现血管内皮损伤是目征微循环异常改变的关键〔15,16〕，其主要机制是：血液流变的异常改变引起了组织缺氧缺血、血管内皮细胞损伤，导致一系列血管异常反应，包括血管强烈收缩、血栓形成、血流瘀滞、血管扩张及血管壁通透性增强、微血管丛增多等，最终引起球结膜微血管形态及色调的改变，例如微血管扭曲、变形、增粗、瘤样改变、渗出与出血、网状畸形及色调变暗等。而CTD-PAH的病理生理特点主要包括：①当原发病累及肺组织导致重度间质性肺炎时，肺毛细血管床减少，超过70%时可以出现低氧血症，引起肺循环阻力增加；②免疫炎性反应导致循环免疫复合物在血管内沉积，导致肺血管炎，使得血管收缩、阻力增加；③内皮系统受损导致内皮素(ET)的合成或释放增多，导致血管收缩、血栓形成；④血管重构〔17,18〕。本实验进一步提示微循环改变与SSc-PAH的发病有关，且与SSc-PAH的疾病进展程度呈正相关。