靶向抑制乳腺癌细胞GLS1基因表达对癌细胞凋亡的影响

赖明华 杨岚淞

(云南省第一人民医院 1乳腺甲状腺外科，云南 昆明 650032；2消毒供应中心)

乳腺癌在女性肿瘤中发病率居首位〔1〕。研究表明，多种恶性肿瘤的发生发展是一个由多基因、多阶段参与的复杂过程，目前已发现多个用于乳腺癌预防和治疗的靶基因〔2〕。谷氨酰胺酶(GLS)1是谷氨酰胺-谷氨酸循环途径中的限速酶，可通过分解谷氨酰胺而提供肿瘤细胞快速增殖所需的重要能量来源〔3〕。在结直肠癌、乳腺癌等肿瘤中发现GLS1基因的过度表达，GLS1表达影响结直肠癌的发生发展，抑制其表达可降低结直肠癌的增殖活力〔4，5〕。有研究发现，乳腺癌中GLS1的表达与患者生存率有关〔6〕。本研究试图证实GLS1对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1试剂及仪器 RPMI1640培养基、青链霉素、胰蛋白酶、胎牛血清均购自美国Bibco；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)试剂购自Sigma-Aldrich公司；膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙锭(PI)细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自碧云天公司；GLS1、p53、survivin、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(p-AKT)抗体购自美国Cell signal公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2细胞培养及GLS1的siRNA转染 人MCF-7乳腺癌细胞购自美国ATCC细胞库。细胞在37℃，5%CO2的饱和湿度培养箱中用RPMI1640培养液(含血清及青链霉素)进行传代培养，实验为生长良好的第3代细胞。转染实验参照LipofectamineTM2000说明书，分别将合成的GLS1 siRNA及无干扰作用的siRNA转染MCF-7细胞，分别标记为GLS1-siRNA组和阴性对照组，细胞中仅加入脂质体的为空白对照组。收集转染48 h的细胞用于检测GLS1表达。

1.3Western印迹 细胞转染48 h后收集细胞，细胞中加入适量的RIPA裂解液裂解细胞30 min，提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，每泳道取等量上样蛋白行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离，分离后转聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脱脂奶粉封闭，4℃孵育一抗过夜，其中GLS1、p53、survivin、PI3K、p-AKT蛋白皆按1∶500稀释，内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)按照1∶1 000稀释，洗膜2次，室温孵育二抗〔1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G〕1 h，洗膜，滴加电化学发光(ECL)试剂曝光显影。

1.4GLS1-siRNA转染对MCF-7细胞活力的影响 采用MTT法检测各组细胞活力。GLS1-siRNA转染MCF-7细胞24、48、72 h后，在每个细胞孔中加入MTT(5 mg/ml)溶液20 μl，常规培养于培养箱内4 h，吸弃上清液，每孔加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡混匀10 min，酶标仪在波长490 nm处测定每孔的吸光度值(A值)。实验重复3次。

1.5GLS1-siRNA转染对MCF-7细胞凋亡的影响 各组细胞凋亡检测采用Annexin V-FITC/PI双染法，利用流式细胞仪检测。收集GLS1-siRNA转染48 h的细胞，磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，胰酶消化后将细胞密度调整为每毫升含1×106个细胞，结合缓冲液悬浮细胞，加入FITC标记的Annexin V和PI各5 μl，避光室温孵育20 min，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。实验重复3次。

1.6统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1GLS1-siRNA转染MCF-7细胞后GLS1的蛋白表达 GLS1-siRNA组GLS1蛋白表达(0.168±0.021)显著低于空白对照组(0.617±0.072，P<0.05)，阴性对照组(0.629±0.075)与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 GLS1-siRNA转染MCF-7细胞后GLS1的蛋白表达

2.2GLS1-siRNA转染降低MCF-7细胞活力 GLS1-siRNA组细胞在转染24、48和72 h后细胞活力均显著低于空白对照组(P<0.05)。见表1。

表1 GLS1-siRNA转染对MCF-7细胞活力的影响值，n=3)

与空白对照组比较：1)P<0.05；下表同

2.3GLS1-siRNA转染诱导MCF-7细胞凋亡 与空白对照组比较，GLS1-siRNA组细胞凋亡率显著升高，survivin蛋白表达显著降低，p53的蛋白表达显著升高(均P<0.05)。见图2，表2。

图2 Western印迹检测GLS1-siRNA转染后MCF-7细胞survivin和p53的蛋白表达

组别凋亡率(%)survivinp53空白对照组1.36±0.250.378±0.0450.134±0.015阴性对照组1.45±0.280.362±0.0410.121±0.013GLS1-siRNA组11.77±1.321)0.182±0.0231)0.347±0.0421)F/P值171.145/0.00025.173/0.00167.155/0.000

2.4GLS1-siRNA转染下调MCF-7细胞PI3K/AKT信号通路 与空白对照组比较，GLS1-siRNA组PI3K和p-AKT蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见图3，表3。

图3 GLS1-siRNA转染对MCF-7细胞PI3K/AKT信号通路的影响

组别PI3Kp-AKT空白对照组0.334±0.0380.120±0.015阴性对照组0.356±0.0410.128±0.016GLS1-siRNA组0.153±0.0191)0.046±0.0081)F/P值32.037/0.00133.754/0.001

3 讨 论

多种癌症发病的分子机制涉及抑癌基因表达的下调和癌基因表达的上调。肿瘤的分子靶向治疗已成为肿瘤治疗热点，大多数肿瘤的靶向治疗是针对各种信号通路中的癌基因，然而，对肿瘤细胞代谢分子的调节也可能是一种潜在的治疗靶点〔7，8〕。谷氨酰胺是在肿瘤细胞中消耗最多的一种氨基酸，其代谢可产生加快细胞增长所需的原料〔9〕。GLS1在谷氨酰胺代谢中发挥重要作用，在人体肿瘤中表达广泛，在多种肿瘤中发挥促肿瘤细胞增长的作用〔10〕。有研究显示，抑制胶质瘤中GLS1基因表达可降低细胞的生长〔11〕。

已有研究显示乳腺癌中GLS1有高表达〔5〕。由于RNA干扰技术可在染色质水平及转录和翻译水平对基因的表达进行调节，且有很强的序列特异性，在基因的肿瘤治疗中也有广泛的应用〔12，13〕，本文提示GLS1可影响乳腺癌细胞的增殖和凋亡。促凋亡基因和抑凋亡基因均可影响乳腺癌细胞的凋亡，p53是一个发现较早的癌症相关抑癌基因，可调节细胞周期及促进细胞凋亡，在包含乳腺癌在内的多种肿瘤中均有研究〔14〕。survivin具有调节细胞周期、促增殖和抗凋亡的功能，在多种肿瘤中表达升高，survivin可作为乳腺癌预后判断指标，抑制乳腺癌中survivin的表达可降低细胞增殖及促凋亡〔15，16〕。本文结果提示GLS1可通过调节p53和survivin的表达影响乳腺癌细胞的凋亡。PI3K/AKT信号通路在多种人类肿瘤表达失调，如乳腺癌、卵巢癌等，影响肿瘤的发生发展〔17，18〕。乳腺癌中PI3K/AKT信号通路的活化率较高，抑制该通路可降低乳腺癌的增殖及诱导凋亡〔19〕。本文结果提示GLS1可通过下调PI3K/AKT信号通路影响乳腺癌的发生发展。

综上，通过RNA干扰抑制GLS1基因在乳腺癌中的表达可降低癌细胞活力，促进细胞凋亡，下调PI3K/AKT信号通路，其中诱导细胞凋亡的方式是下调survivin表达和上调p53表达。GLS1基因可能成为乳腺癌治疗有价值的工具。