芹菜素对非小细胞肺癌细胞HCC827增殖、凋亡的影响及机制

王林梅 冯青青 齐景宪 邵润霞 尚学琴

(1郑州大学第二附属医院呼吸内科，河南 郑州 450014；2云南省第二人民医院肿瘤科)

肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率和致死率极高〔1〕。目前，化疗是主要的治疗手段，但对人体副作用较大，故急需寻找高效、副作用小的治疗方法。芹菜素(API)是一类黄酮类化合物，在大蒜、芹菜、番石榴等中广泛分布，其中在芹菜中的含量最高，具有广泛的药理作用〔2〕。API在抗肿瘤过程中具有重要作用，可抗宫颈癌〔3〕、卵巢癌〔4〕、胃癌〔5〕、鼻咽癌〔6〕等，且可减少心肌损伤〔7〕，但对非小细胞肺癌作用的报道较少。本实验旨在研究API对非小细胞肺癌细胞HCC827的生长和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 非小细胞肺癌细胞HCC827购自中国科学院细胞库，API购自上海阿拉丁公司，RPMI-1640培养基、胎牛血清均购于HyClone公司，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司，细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物有限公司，兔抗人环氧化酶(COX)-2一抗购自英国Abcam，β-actin一抗、β-actin二抗、山羊抗兔二抗均购自北京中杉金桥技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 使用含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基，加入100 μ/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，在37℃，5% CO2恒温箱中培养，每2～3 d用2.5 g/L胰酶消化，以1∶3传代一次。

1.2.2MTT法检测API对非小细胞肺癌细胞HCC827增殖的影响 以每孔4 000个细胞加入96孔板中，分别加入不同浓度的API(0、10、20、40、80 μmol/L)，其中0 μmol/L API为对照，每组设4个重复，分别培养24 h，48 h，72 h后，向每孔中加入20 μl，5 g/L的MTT，继续培养4 h，弃上清，加入DMSO 100 μl溶解，置于摇床震荡10 min，直至结晶完全溶解后，放置酶标仪上于570 nm波长处测定每孔吸光度值(A)。实验重复3次。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率 以每孔5 000个细胞接种于6孔板，细胞贴壁后分别加入不同浓度的API(0、10、20、40、80 μmol/L)，每孔1 ml，继续培养24 h后，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书的指示，上流式细胞仪检测。

1.2.4Western印迹检测COX-2蛋白表达 将待提取蛋白的细胞中加入20 μl细胞裂解液，沸水浴5 min，离心后对蛋白质进行定量，取60 μg总蛋白，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，置于5%的脱脂牛奶封闭90 min，加入β-actin一抗(1∶1 000)和兔抗人COX-2一抗(1∶1 500)4℃过夜，加入β-actin二抗、山羊抗兔二抗(1∶60 000)作用1 h，用TBST洗膜4次，滴加电化学发光(ECL)显色液，在凝胶成像系统下测定灰度值。相对蛋白表达量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值

1.2.5统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差检验、SNK-q检验。

2 结 果

2.1API对HCC827细胞增殖的抑制作用 API对HCC827细胞增殖抑制率呈显著浓度和时间依赖性，随浓度增加及时间延长抑制率显著增加(均P<0.05)。见表1。

2.2API对HCC827细胞的诱导凋亡作用 随API浓度的增加，不同时期凋亡细胞比例显著升高，呈现浓度依赖性(均P<0.05)。见表2。

表1 API对非小细胞肺癌HCC827细胞的增殖抑制作用

与同时间前一浓度相比：1)P<0.05；与同浓度前一时间相比：2)P<0.05

表2 API对非小细胞肺癌HCC827细胞的诱导凋亡作用

与前一浓度比较：1)P<0.05

2.3API对COX-2蛋白表达的影响 不同浓度API(0、10、20、40、80 μmol/L)COX-2蛋白表达分别为：(0.987±0.024)、(0.903±0.036)、(0.843±0.025)、(0.768±0.027)、(0.703±0.031)。随API浓度增大COX-2蛋白表达明显降低(均P<0.05)。见图1。

图1 API对COX-2蛋白表达的影响

3 讨 论

非小细胞肺癌约占原发性肺癌的80%〔8〕。手术治疗和化学治疗是治疗肺癌的传统手段〔9〕。大部分晚期患者不能实行手术治疗；化学治疗对机体的副作用较大。分子靶向治疗和中西医药结合的方式逐渐成为研究的热点，但是部分患者会出现耐药性，不适合分子靶向治疗〔10〕。

API具有多种生物学活性和药理作用，其中最受关注的是其抗肿瘤作用。API能抑制人小细胞肺癌NCI-H446细胞系球细胞自我更新作用〔2〕；抑制胶质瘤SHG-44细胞增殖，并通过线粒体信号通路诱导其凋亡〔11〕；能够抑制人肺癌NCI-H1299 细胞的增殖，并诱导其凋亡〔12〕。本实验研究结果表明，API能有效抑制非小细胞肺癌HCC827细胞的生长增殖，并且随着时间的延长和浓度的增加其抑制效果越明显。API对非小细胞肺癌HCC827细胞的凋亡具有促进作用，其作用对时间和浓度具有依赖性，与抑制增殖的结果一致。

COX-2于正常机体中没有表达，其在细胞发生病理变化时会迅速合成，参与炎症过程及肿瘤的发生〔13〕。研究发现，前列腺素合成通路上的关键酶COX-2与肺癌的发生关系密切〔14〕，并在非小细胞肺癌中高度表达〔15〕。另有研究显示COX-2通过抑制凋亡、诱导肿瘤血管生成、抑制免疫功能和肿瘤侵袭等多个环节参与肿瘤的生成〔16,17〕。本研究结果说明API对COX-2蛋白表达有明显抑制作用。

综上，API作为一种植物提取的天然活性成分，能够抑制非小细胞肺癌HCC827细胞的增殖，并诱导其凋亡，有望成为一种新型的、副作用小的抗肺癌药品，但其具体作用机制尚不清楚。