恒古骨伤愈合剂通过PI3K/AKT/GSK-3β信号通路治疗树鼩绝经后骨质疏松的作用机制

郑红 赵宏斌 袁鑫 吴超 角建林 唐薇

(昆明医科大学 1实验动物学部，云南 昆明 650500；2第一附属医院；3技术转移中心)

骨质疏松(OP)是一种全身代谢性骨骼疾病，其特征是骨量减少、骨骼微观结构退化，最终导致骨脆性增加，使患者易于发生骨折〔1,2〕。绝经后骨质疏松(PMOP) 是由于女性绝经以后机体雌激素水平下降而引发的〔3〕，是OP中最重要的一种形式，病人年龄通常界定在50～70 岁。PMOP在中医上属 “骨痿、骨痹”的范畴，而肾虚是其根本原因。中医理论认为肾藏精，主骨生髓〔4〕，因此，骨骼的生长、发育及修复等功能均依赖于肾中精气的蓄存和滋生。源自云南彝药的恒古骨伤愈合剂(OK)，是我国拥有自主知识产权的民族药物。OK主要由三七、红花、陈皮、杜仲等中草药配制而成，具有滋阴益肾、补肾温阳、补脾益气、气血双补等功效，符合中药治疗PMOP的药理学需求〔5,6〕。在本次研究中，笔者将最接近灵长类的实验动物树鼩去除卵巢创建PMOP模型，评价OK的促骨形成作用及对PMOP的治疗效果，特别是其对在成骨细胞增殖和分化过程中起重要作用的信号通路磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/糖原合成酶(GSK)-3β所起的调控作用。

1 资料与方法

1.1实验动物 60只12月龄雌性滇西亚种树鼩，体重100～120 g，昆明医科大学实验动物学部提供，生产许可证号：SCXK(滇)K2013-0002，使用许可证号：SYXK(滇)K2015-0002。所有树鼩单笼饲养，实验室温度 20～25℃，湿度控制在20%～30%，自由摄食、饮水，实验动物基础颗粒饲料和水果混合饲料喂养，适应性喂养2 w后用于实验。

1.2实验药品及主要试剂 OK(由三七、黄芪、人参、红花、杜仲、鳖甲、陈皮等配方制成,每毫升中生药含量为 0.36 g)由云南克雷斯天然药物制药厂生产，国药准字：Z20025103；结合雌激素片(新疆新姿源生物制药有限责任公司，批号20130802)；雌二醇(E2)、骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(OC)和I型原胶原N-端前肽(PINP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RNA总提取试剂盒(北京Tiangen公司)；第一链逆转录试剂盒(美国Promega公司)；引物基因合成(美国Invitrogen公司)；荧光PCR染料混合液(瑞士Roche公司)；PI3K、AKT、GSK-3β和 β-actin一抗(美国Cell Signal Technology公司)；相应辣根酶标记的二抗(北京中杉金桥公司)；电化学发光法(ECL)发光试剂盒(美国Millipore公司)。

1.3主要仪器和设备 紫外分光光度计及电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；瑞士罗氏cobas c 311全自动生化分析仪；全波段酶标仪(Thermo fisher公司)；低温离心机(德国Eppendorf公司)；垂直电泳系统(美国Bio-Rad公司)；7300实时荧光定量 PCR仪(美国 ABI公司)；Prodigy-BX IL双能X线(DXA)骨密度(BMD)测量仪(美国Lunar公司)。

1.4分组及给药 60只实验树鼩中随机选取10只作为正常组(不做任何处理)，剩余50只去除两侧卵巢(树鼩全身BMD检测下降25%)作为PMOP模型动物，再随机分为模型组(每天生理盐水灌胃)，OK低、中、高剂量组(分别给予OK 0.5、1.5和3.0 ml/d灌胃治疗)，阳性药对照组给予1.5 ml/d 结合雌激素灌胃治疗)，每组10只。10 w后处死树鼩。

1.5BMD检测 各组树鼩腹腔注射水合氯醛麻醉，俯卧位固定于DXA BMD测定仪实验台上，拉直脊柱后行DXA测定BMD。

1.6标本收集 实验树鼩处死前禁食不禁水12 h，称量并记录体重后，腹腔注射3.6%水合氯醛(1 ml/100 g)，心脏采血，室温放置1～2 h后，3 500 r/min离心10 min，收集血清，取右侧下肢钝性分离，剥离干净皮肤和肌肉组织，生理盐水洗净骨头后，置于液氮中速冻，取出溶解，如此重复3次后，研磨成粉浆状存于-80℃保存备用。

1.7血生化相关指标检测 各组树鼩取血清，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定E2、BALP和OC、PINP的含量，具体步骤按照试剂盒说明进行操作。

1.8RT-qPCR检测相关指标mRNA表达水平 取各组树鼩右下肢骨组织，经液氮速冻和反复研磨好的骨组织约100 mg超声粉碎，Trizol提取总RNA，定量后反转录为随机 cDNA，加入引物及荧光染料进行扩增。反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸35 s，循环40次，72℃最后再延伸5 min。结果采用RT-qPCR 相对扩增分析法 2-ΔΔCt法进行统计分析，每组实验至少重复3次。引物设计见表1。

表1 引物设计序列

1.9Western印迹检测相关指标蛋白表达水平 取出研磨好的骨组织约1 g，加入RIPA组织裂解液和蛋白酶抑制剂(PMSF)匀浆，蛋白定量后沸水浴约15 min，每个样品取50 μg进行十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶电泳，半干法转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脱脂奶粉封闭2 h，孵育一抗4℃过夜，二抗孵育2 h，加入化学发光试剂 ECL显色，曝光，以β-actin作为内参，扫描图像，用Image J软件计算各条带的吸光度值，每组实验至少重复3次。

1.10统计学分析 采用SPSS19.0软件，两组间计量资料比较采用t检验，多组计量资料比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1OK对各组体重和E2的影响 与正常组比较，模型组体重明显变高，具有统计学意义(P<0.05)；而药物灌胃治疗后体重略有下降，但与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组比较，模型组E2含量下降明显，经OK灌胃治疗后，E2含量逐渐升高，表现出剂量依赖性，且与模型组相比，OK中剂量与高剂量组治疗效果具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.2OK对BMD的影响 与正常组〔(0.23±0.02)g/cm2〕相比，模型组BMD〔(0.13±0.01)g/cm2〕降低明显，差异有统计学意义(P<0.05)，治疗10 w后，各治疗组BMD逐渐增加〔OK低、中、高剂量组分别为(0.14±0.01)、(0.18±0.01)、(0.22±0.02)g/cm2〕，且随OK剂量增加，治疗效果更加明显；此外，阳性药对照组BMD〔(0.18±0.02)g/cm2〕也升高明显，与OK中剂量组效果相当。

表2 各组体重及E2含量、成骨标志物对比

与正常组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05；下表同

2.3OK对各组成骨因子的影响 模型组血清BALP、OC和PINP的含量相较于正常组明显降低(P<0.05)，表明去除卵巢诱导的PMOP树鼩模型建立成功。经过OK灌胃治疗后，各治疗组血清BALP、OC和PINP含量都有所增加，呈现出剂量依赖性，特别是OK中、高剂量组治疗效果均具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性药对照组血清BALP、OC和PINP的含量也有所增加(P<0.05)，疗效与OK中剂量相仿，见表2。

2.4OK对PI3K/AKT/GSK-3β信号通路mRNA的影响 模型组PI3K mRNA表达水平(2-ΔΔct值)比正常组明显降低(P<0.05)，GSK-3β mRNA表达水平比正常组明显升高(P<0.05)。经过OK灌胃治疗后，各治疗组PI3K mRNA表达水平明显升高，GSK-3β mRNA表达水平明显降低，且效果都呈现出剂量依赖性，特别是OK中、高剂量组差异均具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性药对照组PI3K mRNA表达水平也增加(P<0.05)，GSK-3β mRNA表达水平也明显降低，疗效与OK中剂量相仿；而各组AKT mRNA表达水平无明显变化(P>0.05)，见表3。

2.5OK对PI3K/AKT/GSK-3β信号通路蛋白因子的影响 与mRNA检测结果一致，模型组PI3K蛋白表达水平比正常组明显降低(P<0.05)，GSK-3β蛋白表达水平比正常组明显升高(P<0.05)。OK灌胃治疗后，各治疗组PI3K蛋白表达水平明显升高，GSK-3β蛋白表达水平明显降低，且效果都呈现出剂量依赖性，特别是OK中、高剂量组差异均具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性药对照组PI3K蛋白表达水平也增加(P<0.05)，GSK-3β蛋白表达水平也明显降低，疗效与OK中剂量相仿。各组总AKT蛋白表达水平没有明显变化(P>0.05)，但AKT的磷酸化(308位点)〔p-AKT cThr 308)〕水平变化明显，在模型组中AKT的磷酸化水平明显降低(P<0.05)，而OK灌胃治疗后AKT磷酸化水平逐渐升高，呈现出剂量依赖性，与模型组相比，OK中剂量和高剂量组差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3，见图1。

表3 各组PI3K、AKT和GSK-3β mRNA和蛋白水平对比

图1 各组PI3K、AKT和GSK-3β蛋白表达比较

3 讨 论

肾气虚损和“骨枯” 密切相关，也就是说肾虚是OP的根本病因〔7〕。原发性OP主要发生在绝经后妇女和老年人群中，主要表现为四肢酸软、腰背疼痛、驼背及易于骨折等。临床中常用双膦酸盐类、降钙素类及雌激素类药物治疗PMOP，这些药物主要作用都是抑制骨吸收〔8〕，而促骨形成的药物相对较少，因此，寻找安全高效经济的骨形成促进剂是临床的迫切需求。应用中药促骨形成治疗PMOP适合中国国情，具有较广阔的应用前景。来自我国云南彝族的民族特色药物OK 由三七、红花、陈皮、杜仲等配方制成，为治疗骨折、骨病等的内服方药。本实验结果显示，OK具有优良的促骨形成作用。

OK能够通过促骨形成的作用缓解PMOP，但这种成骨作用是否通过促进细胞增殖的方式目前不得而知，因此，本文也对此进行了研究。包括 PI3K/AKT/GSK-3β和Wnt/β-catenin等在内的多条细胞信号通路调控着细胞的增殖分化，特别是PI3K/AKT/GSK3β信号通路长期以来都是研究细胞增殖和抗凋亡信号领域的热点〔9〕。作为PI3K下游的直接靶点蛋白,PI3K一旦激活后，可以使磷肌醇类因子发生磷酸化，从而发挥生物活性，特别是PI3K能够磷酸化AKT的第308位酪氨酸从而激活AKT,因此其是该蛋白质活性的调节枢纽〔10〕。GSK-3β是其下游因子，是体内第一个被发现的AKT作用底物,AKT可使GSK-3β第9位丝氨酸磷酸化,降低GSK-3β的磷酸化水平从而诱导细胞凋亡；GSK-3β 作为 PI3K /AKT 通路下游重要的位点，主要作用是调控糖原的合成与代谢，除此之外其在调控细胞增殖和分化的过程中也发挥了广泛的作用。GSK-3β 也是Wnt/β-catenin 信号途径的关键因子，可以磷酸化 β-catenin 的丝氨酸/苏氨酸残基，进而促进 β-catenin 被泛素化降解，调控骨细胞的增殖〔11,12〕。本实验发现，OK能够上调PI3K的表达水平和AKT的磷酸化水平，并且下调GSK-3β的表达水平，这与实验初期的假设是一致的，说明OK可以通过促进骨细胞增殖的作用缓解PMOP，并且这种治疗作用可能是通过调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路实现的，但其具体分子机制还需进一步研究。