FTY720对他克莫司所致大鼠肾损伤的保护作用

张隆业 金吉哲 郑海兰 金健 朴尚国 李慧瑛 姜玉姬 金英顺 李灿

(延边大学附属医院肾病学科，吉林 延吉 133000)

长期使用他克莫司(TAC)可引起继发性糖尿病和肾脏损伤，其中肾脏损伤表现为肾小管间质炎性细胞浸润、纤维化及肾小管萎缩〔1〕。TAC所致肾损伤与激活的血管紧张素系统、炎性介质、致纤因子、一氧化氮及其酶失衡紧密相关〔2～4〕。研究表明免疫系统参与了组织修复和损伤过程。在缺血再灌注模型中，CD4/CD8敲除小鼠比C57BL/6对照组小鼠表现为较好的肾功能状态〔5〕。另外，给予T细胞耗竭抗体显著改善小鼠缺血再灌注所致肾功能和肾组织损伤，表明T淋巴细胞在组织损伤过程中扮演着重要角色〔6〕。本实验利用动物模型探讨淋巴细胞特异性抑制剂FTY720是否对TAC所致肾损伤具有保护作用。

1 材料和方法

1.1动物分组与药物治疗 雄性Sprague-Dawley大鼠 (Charles River，Technology，韩国) 体重220～240 g，在给予低盐饲料(0.05% sodium，Teklad Premier，Madison，WI，USA) 1 w后随机分成四组予以如下治疗4 w：①正常对照组(n=6)：给予皮下注射橄榄油(1 ml·kg-1·d-1)；②FTY720组(VH+FTY，n=6)：给予橄榄油和灌胃FTY720(0.125 mg·kg-1·d-1)；③TAC组(n=8)：给予皮下注射TAC(1.5 mg·kg-1·d-1)；④TAC+FTY720组(n=8)：同时给予TAC和FTY720；4 w后处死大鼠，收集血液、尿液、肾组织标本以备进一步检测。该动物实验得到韩国加图立大学动物伦理委员会批准 (CUMC-2017-0101-05)。

1.2生化检测 定期测量各组大鼠的体重；尾压法测定收缩期血压(BP-2000，Visitech system，Apex，NC)；全自动生化分析仪测定血白细胞计数(ADVIA 120，日本拜耳公司)；标准酶比色法测定血肌酐(Scr)及血尿素氮(BUN)(Stanbio Laboratory,Boerne,TX,USA)；May-Grun-wald和Giemsa染色法计数淋巴细胞数；单克隆放射免疫法检测全血TAC浓度(Incstar Co.，Stillwater，MN)。

1.3肾脏病理 肾脏组织由过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛液(PLP)固定，石蜡包埋后4 μm切片，行Masson三色染色，采用彩色图像自动分析仪(Olympus，日本)高倍镜视野下分析肾小管间质纤维化程度，每个标本至少观察20个非重叠肾小管间质取平均值。

1.4免疫组织化学染色 步骤简述如下：石蜡包埋切片置二甲苯脱蜡，梯度酒精中脱水，37℃下 0.3%过氧化氢/甲醛30 min处理后，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次。置微波炉中加热行波炉抗原修复(98℃ 5 min)。室温下非免疫性血清封闭液20 min。在4℃下滴加ED-1单克隆抗体(Serotec Inc.，UK)孵育12～16 h。PBS液洗3次后滴加二抗，室温孵育2 h。以二氨基联苯胺(DAB)为底物显色，呈棕黄色为止。自来水流水洗涤，复染苏木素，常规树脂封片。CD3、CD8(Serotec，Raleigh，NC)、骨桥蛋白(OPN，MPIIIB10，Iowa，IA)的染色步骤同前。染色程度用数字化显微镜分析仪(Olympus，日本)，Polygon 程序算出每0.5 mm2染色数。

1.5Western印迹法 肾组织利用蛋白质裂解液制成匀浆，常温下离心取上清液测定蛋白浓度(Bio-Rad，Hercules)，20 μg的标本在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转膜2 h后，4℃下置转化生长因子(TGF)-β1抗体(Santa Cruz公司，USA)于非脂牛乳中以1∶1 000浓度孵育12～16 h，室温下缓冲液洗涤3次，加辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG(Amersham)1 h，室温下缓冲液洗涤3次增强发光(ECLTM，Amersham)和曝光。以对照组为标准(100%)测定条带密度，以β-actin(Sigma，USA)校正。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1FTY720 对基本数据及肾功能的影响 TAC 组大鼠表现为体重下降、肾功能恶化(Scr和BUN的上升)；FTY720虽然对体重下降无影响，但可以明显改善肾功能；各组间收缩期血压无显著性差异；FTY720治疗减少TAC所致全血白细胞数和淋巴细胞数的升高。见表1。

2.2FTY720对各组肾组织中T淋巴细胞的作用 在正常肾组织中很少检测到CD3和CD8阳性细胞数。然而在TAC组大鼠肾小管间质中可观察到大量的CD3和CD8阳性细胞(图1和图2)，给予FTY720治疗明显减少TAC 所致CD3和CD8阳性细胞浸润(均P<0.05)。见表2。

表1 各组基本数据及肾功能比较

ND：未检测；与正常对照组比较：1)P<0.05;与TAC组比较：2)P<0.05，下表同

图1 各组肾组织CD3阳性细胞(DAB，×400)

2.3FTY720对炎症反应的作用 正常肾小管间质偶见OPN蛋白的表达和ED-1阳性细胞，而TAC组肾组织中可以见到较强的OPN和ED-1的免疫反应性，其主要位于受损的肾小管和间质(图3和图4)；与TAC组相比，FTY720治疗削弱OPN和ED-1的免疫反应性。以上结果提示，FTY720对TAC所致肾损伤具有抗炎作用。见表2。

图2 各组肾组织CD8阳性细胞(DAB，×400)

图3 各组肾组织ED-1阳性表达(DAB，×400)

图4 各组肾组织OPN阳性表达(DAB，×400)

组别nCD3阳性细胞(个/0.5 mm2)CD8阳性细胞(个/0.5 mm2)ED-1阳性细胞(个/0.5 mm2)OPN阳性细胞表达(%/0.5 mm2)TIF(%/0.5 mm2)TGF-β1/β-actin(%)正常对照组67.2±2.44.1±2.97.8±2.15.2±1.10.3±0.1100.0±2.5FTY720 组65.6±2.73.9±1.65.9±1.54.9±0.90.5±0.1105.3±4.7TAC组821.3±4.11)17.2±2.41)42.8±7.31)30.1±3.11)17.9±2.61)890.5±45.81)TAC+FTY720组813.8±2.81)2)10.2±2.11)2)28.7±5.31)2)16.3±2.81)2)12.5±2.31)2)573.7±40.21)2)

2.4FTY720对肾小管间质纤维化的作用 图5示在TAC组中可见到典型的肾小管间质纤维化形成，同时给予大鼠FTY720明显改善肾小管间质纤维化。TAC组TGF-β1蛋白的表达上调；FTY720显著下调TGF-β1蛋白的表达，见图6，提示FTY720对TAC所致肾损伤具有抗纤维化作用。见表2。

图5 各组肾小管间质纤维化Masson染色(×400)

1～4:正常对照组、FTY720组、TAC组、TAC+FTY720组图6 各组肾组织TGF-β1表达

3 讨 论

本研究结果表明入侵的T淋巴细胞在TAC诱导的肾损伤中起着重要角色，而 FTY720是有效的治疗手段之一。据报道在慢性自身免疫性脑脊髓炎中，FTY720抑制巨噬细胞聚集〔7〕；另外，FTY720 改善抗TY-1抗体所致肾小球硬化模型的肾小管间质纤维化〔8〕，提示FTY720具有保护作用。本实验中，FTY720减少TAC所致肾小管间质炎性反应和纤维化形成。在分子水平上，FTY720治疗明显下调炎性介质OPN的表达，继之减少巨噬细胞浸润。此外，FTY720下调TGF-β1蛋白的表达，防止肾小管间质纤维化。本实验结果与Rausch等〔7〕及Peters等〔8〕对 FTY720 具有抗炎抗纤维化作用的报道相一致。然而，这种作用是否与减少的T淋巴细胞有关尚不清楚，可能与以下几点有关：第一，TAC诱导大量的淋巴细胞浸润，并与巨噬细胞相互作用共同参与了炎性反应〔9〕；第二，入侵的淋巴细胞局部释放一定数量的炎性介质和促纤维化生长因子，其中包括TGF-β1，其可直接增强纤维化形成〔10〕；第三，激活的肾内血管紧张素系统参与了T淋巴细胞所介导的肾损伤，因为直接注射血管紧张素(Ang)Ⅱ引起肾脏大量T淋巴细胞的浸润，然而阻断AngⅡ该效应则消失〔11〕。本研究表明T淋巴细胞介导TAC诱导的肾损伤，但异型抗原非依赖的组织损伤如TAC肾病是否激活T淋巴细胞还不清楚。我们曾报道过TAC或环孢素(Cs)A诱导的肾毒性活化Toll样受体、产生内源性Toll样受体配体、热休克蛋白70，并引起树突细胞成熟，它是T淋巴细胞激活所必备的因素之一〔12〕。因此，TAC所致肾损伤有可能激活固有免疫和T淋巴细胞，扮演清道夫角色，促进组织修复，类似的结果亦可在缺血再灌注模型中观察到〔13〕，说明激活的T淋巴细胞起到两种截然不同功能，在特定的环境下参与组织器官的损伤或修复。因此，非免疫性因素也可引起免疫反应，T淋巴细胞有可能在固有免疫和获得免疫中起到桥梁作用。

FTY720 是一类特异性淋巴细胞抑制剂，但它还具有T淋巴细胞-非依赖效应，如增加内皮屏障功能、保持血管完整性、抗纤维化等〔14〕，其肾脏保护作用在缺血再灌注〔15〕、高血压肾损模型〔16〕、5/6肾切除模型〔17〕中相继被报道。因此，使用T淋巴细胞抗体或CD3/CD8基因敲除动物观察是否可减轻各种肾脏损伤有待于进一步探讨。任何一种药物都有益处和不良反应，为避免毒副作用的发生剂量选择显得尤为重要。以往研究表明，FTY720在0.05～10.00 mg·kg-1·d-1剂量范围下对同种异体移植的诸多模型具有强有力的免疫抑制作用〔18〕。本实验选择FTY720(0.125 mg·kg-1·d-1)剂量不仅减少了TAC所致肾损伤，而且对血TAC浓度没有影响，与临床上患者使用后血药浓度极相近(0.25～3.50 mg)。总之，低剂量FTY720能有效地减少TAC相关的肾损伤、改善肾功能、防止排斥事件发生，具有肾脏保护作用。