归脾汤对化疗相关性疲劳模型TNF-α分泌的调节效应

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(辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室,辽宁 沈阳 110847)

化疗是目前治疗恶性肿瘤的手段之一，但其化疗产生的副作用也逐渐显现。化疗相关性疲劳(Chemotherapy-induced Fatigue，CIF)目前越来越引起人们的重视，它主要表现为化疗后出现乏力、失眠、抑郁等多方面扰乱机体正常功能的心理和行为症状，严重影响着患者的身心健康，甚至还会影响治疗效果。化疗相关性疲劳的特点是发生快、程度重、持续时间长、不能通过休息缓解。目前对CIF发生的具体机制尚未有明确的阐述，也未发现能够有效预防或治疗CIF的药物。有关研究表明一些常见的化疗药物(如5-氟尿嘧啶、依托泊苷、多柔比星等)可刺激机体释放多种炎性因子如TNF-α等，使机体发生一系列生理病理改变[1]。但究竟炎症因子的分泌是否是化疗后产生疲劳的发生机制之一还尚未明了。因此,本研究的目的是通过5-氟尿嘧啶进行造模，初步探究CIF模型中TNF-α的分泌情况，并利用归脾汤对其进行免疫调节，探讨其可能的机制。

归脾汤始载于宋代严用和《济生方》,主治心脾两虚之健忘、怔忡。元代危亦林《世医得效方》增补治疗脾不统血而妄行之吐血下血。明代薛立斋《校注妇人良方》在原方中增加了当归、远志两味,一直沿用至今。归脾汤为中医经典名方,在临床各科得到广泛应用[2]。归脾汤由人参、白术、黄芪、当归、甘草、茯神、远志、酸枣仁、木香、龙眼肉、生姜、大枣组成，其中黄芪、龙眼为君补血养心；人参、白术、当归为臣补气健脾；茯神、酸枣仁、远志、木香为佐宁心安神；炙甘草为使调和诸药，加姜枣调和脾胃，诸药合用，具有益气补血、健脾养心的作用[3]。化疗相关性疲劳，从中医学角度来看，可归属于中医“虚劳”的范畴，我们认为其发生的机制与中医脾的功能有关，而归脾汤具有健脾的功能，因此，探究归脾汤是否能改善化疗相关性疲劳及其初步作用机制是我们研究的重点。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级健康C57BL/6小鼠，6周龄，雌雄各半，共80只。(北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK(京)2012-0001，于辽宁中医药大学实验动物中心饲养)

1.2 主要试剂与药物

5-氟尿嘧啶(5-Fu)(天津金耀氨基酸有限责任公司，20151003)，香菇菌多糖片(江苏长江药业有限公司)，归脾汤(药用白术30 g、人参15 g、黄芪30 g、当归15 g、炙甘草8 g、茯神30 g、远志15 g、酸枣仁30 g、木香15 g、龙眼肉30 g；购于国大药房，常规煎煮，浓缩为终浓度1 g/mL)[4]，TNF-α检测试剂盒(武汉优尔生公司，L160607273)。

1.3 主要仪器

大小鼠抓力测定仪(济南益延科技发展有限公司，型号YLS-13A)，全自动酶标仪(奥地利Anthos公司，17550型)，电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂，HXP-9052MBE型)，离心机(法国Jouan 公司，C4-12型)。

2 方法

2.1 分组及造模、灌胃方法

2.1.1 实验分组 将小鼠随机分成4组，即空白对照组(A组)、化疗疲劳组(B组)、香菇多糖组(C组)、归脾汤组(D组)每组各20只。实验前正常预养1周。

2.1.2 CIF模型制备及灌胃方法 参考文献[5]方法，将除A组以外的小鼠腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-Fu)，剂量为40 mg/kg，每天给药1次，连续5天。同时，空白对照组给予生理盐水腹腔注射。造模前两天C组给予2 mg/kg香菇多糖0.5 mL/只、D组给予归脾汤灌胃(0.3 mL/10g·BW)，A组和B组等量生理盐水灌胃0.5 mL/只，共14天。第15天处死取腹腔巨噬细胞、脾和胸腺。

2.2 观察归脾汤对CIF模型疲劳状况的影响

2.2.1 小鼠体重变化 每6天测一次各组小鼠体重。

2.2.2 抓力测定 先用右手将鼠放在抓力仪上，左手向前推抓力板，然后右手向后滑至鼠尾，左手轻轻松开抓力板，待鼠用力抓住抓力板时，及时加力向后拉，以得到最大抓力。

2.3 观察归脾汤对CIF模型TNF-α分泌的影响

2.3.1 腹腔巨噬细胞提取和培养 实验前三天，向小鼠腹腔内注入6 %无菌淀粉肉汤lmL，以刺激聚集大量的巨噬细胞。颈椎脱臼处死小鼠，将其全部浸入75 %乙醇中浸泡5 min。注射器吸取5 mL PBS液注入小鼠腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。用针头轻轻挑起腹壁并微微倾向一侧，使腹腔中液体集中于针头下，将腹腔液吸取入针管内。小心拔出针头，把液体注入离心管。4℃下2 000 rpm离心10 min后，弃上清，加3 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液。计数细胞，调整细胞浓度为1×106/mL。每孔加入100 μL细胞悬液，空白对照孔只加100 μL含10 %胎牛血清的RPMI1640培养液。37 ℃，5 %CO2培养箱中孵育2h，倒置显微镜下观察。除去未贴壁细胞，PBS液冲洗1～2次。每孔加入含10 %胎牛血清的RPMI1640培养液，置37 ℃，5 %CO2培养箱中继续培养24 h后取培养上清液。

2.3.2 炎性细胞因子TNF-α的水平检测 取腹腔巨噬细胞，按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，观察各组TNF-α的分泌水平。

2.4 统计方法

3 结果

3.1 归脾汤对CIF小鼠体重的影响

由表1可见，实验初始时，各组小鼠的体重无明显差异。实验第6天时，与A组相比，B、C组小鼠的体重均显著低于A组(均P<0.01)，而D组小鼠经过归脾汤的治疗，体重明显高于B组(P<0.01)。实验第12天时，B组与C组小鼠的体重仍显著低于A组(均P<0.01)，而D组小鼠体重继续增长，仍显著高于B组(P<0.01)，且已与A组无差异(P>0.05)。

组别初始第6天第12天A组23.83±0.7324.40±1.84△△24.21±1.08△△B组23.58±0.7122.01±0.95∗∗21.48±1.37∗∗C组23.23±0.6121.54±1.00∗∗22.20±1.55∗D组23.32±1.0823.72±1.15△△24.64±1.20△△

注：**表示与A组相比,P<0.01；△表示与B组相比,P<0.05；△△表示与B组相比,P<0.01。

3.2 归脾汤对CIF小鼠抓力的影响

由表2可知，实验初始时，各组小鼠的抓力无明显差异。实验第6天时，与A组相比，B组小鼠抓力显著降低(P<0.05)，C组小鼠抓力比B组高，但无统计学意义，而D组小鼠的抓力明显高于B组(P<0.01)。实验第12天时，除A组小鼠的抓力仍继续增长外，B组基本无变化，而C组和D组小鼠抓力均比第6天时有所下降。

3.3 归脾汤对CIF小鼠胸腺指数和脾指数的影响

由表3可见，B、C、D组小鼠的胸腺指数均显著低于A组(均P<0.01)。与B组相比，C组小鼠的胸腺指数略高于B组，但无统计学差异，而D组小鼠的胸腺指数显著高于B组(P<0.01)。

组别初始第6天第12天A组189.0±24.5225.2±57.6△248.8±57.3△△B组186.5±27.1179.8±41.4∗180.0±39.3∗∗C组187.9±36.9213.0±60.9193.0±62.9∗D组184.4±18.0241.2±35.9△△230.3±41.1

注：*表示与A组相比,P<0.05；**表示与A组相比,P<0.01；△表示与B组相比,P<0.05；△△表示与B组相比,P<0.01。

组别胸腺指数脾指数A组1.6±0.14△△3.1±0.93B组0.6±0.19∗3.0±0.86C组0.8±0.11∗3.6±0.33∗△△D组1.1±0.14∗△△3.8±0.96∗△△

注：*表示与A组相比,P<0.01；△表示与B组相比,P<0.05；△△表示与B组相比,P<0.01。

同时，与A组相比，B组的脾指数无明显变化，但C、D组小鼠的脾指数均显著高于A组和B组(P<0.01)。

3.4 归脾汤对CIF小鼠TNF-α分泌的影响

由图1可知，与A组相比，B组小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的分泌水平明显升高(P<0.01)。与B组相比，C组TNF-α的分泌水平降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，而D组TNF-α的分泌水平显著低于B组(P<0.01)。

图1 归脾汤对CIF小鼠TNF-α分泌的影响

组别TNF-αA组126.5±28.04△B组219.4±48.68∗C组170.9±38.28D组140.3±33.01△

注：*表示与A组相比,P<0.01；△表示与B组相比,P<0.01。

4 讨论

实验初各组小鼠的体重和抓力无显著性差异，B组与C组小鼠的体重在实验过程中均先降低后升高，但仍显著低于A组(P<0.01)。而D组小鼠的体重一直呈上升趋势，在实验结束时的体重与A组已无差异(P>0.05)。实验第6天时，B组抓力显著降低，抓力的下降说明造模成功。C组小鼠抓力高于B组，但差异无统计学意义(P>0.05)，D组小鼠的抓力较B组明显升高(P<0.01)。这说明化疗在大幅度消耗体重的同时也会损害肌力从而使抓力下降，经过归脾汤的治疗会使体重和抓力均明显升高，而香菇多糖的治疗效果不如归脾汤。脾主四肢(肌肉)，归脾汤具有健脾益气的作用，所以经过治疗后抓力会上升，而后可能由于物质消耗或者化疗药物的毒副作用在小鼠体内不断累积而使小鼠在第12天时的抓力较第6天时有所下降。

与A组相比，B、C、D组小鼠的胸腺指数显著降低(P<0.01)，这表明化疗会损伤胸腺而使胸腺指数明显降低。C组和D组小鼠的胸腺指数虽低于A组但均高于B组，且D组小鼠的胸腺指数高于C组，这说明经过药物的治疗后会使胸腺指数升高，且归脾汤疗效高于香菇多糖。胸腺是T淋巴细胞发育成熟的场所，而T淋巴细胞可通过细胞免疫机制调节机体的免疫水平，归脾汤可以使胸腺指数升高，说明归脾汤对免疫功能具有一定的促进作用[6]。此外，归脾汤具有益气养血和健脾的作用，且C组小鼠的脾指数高于A组,这说明归脾汤对脾脏有一定的免疫调节功能。

TNF-α属于Th1型细胞因子，主要由单核巨噬细胞产生，具有极强的促炎作用，可诱发并加重炎症反应，过量的TNF-α会引起免疫系统功能的紊乱从而对机体产生损伤反应[7]。此外，TNF-α在介导机体感染免疫、肿瘤免疫、自身免疫等多方面均发挥着重要的作用[8]。B组小鼠TNF-α的分泌水平明显升高可能是CIF的发病机制之一，而经过归脾汤治疗后，TNF-α的分泌明显降低，接近但不能恢复到正常水平，说明归脾汤有一定的降低TNF-α分泌水平的作用。

化疗引起的相关性疲劳，从中医学角度看，可归属于中医“虚劳”的范畴。虚劳时人体处于脏腑气血阴阳亏虚的状态，而中医认为，“脾胃为气血生化之源”。脾胃的化源不足、升降失司会引起功能的异常，从而有身重体倦、四肢乏力及免疫力低下的表现。归脾汤具有显著的健脾功能，可以通过提高胸腺指数、脾指数并降低TNF-α的分泌水平，提高机体免疫力，从而有效缓解化疗引起的相关性疲劳，更深入的机制有待进一步的研究。