双硫仑联合铜对肺癌脑转移癌细胞增殖和迁移的影响*

罗才奎，涂勤，余小祥，孟亮，樊文，陶亮

[武汉大学附属同仁医院(武汉市第三医院)神经外科，武汉 430060]

脑转移癌是常见的中枢神经系统肿瘤之一，多指原发于身体其他部位的肿瘤通过某种途径转移到颅内，并形成新的病灶，转移癌占颅内肿瘤约10%，20%～40%癌症患者有颅内转移，发生年龄与全身肿瘤相同，以40～60岁多见。肿瘤细胞可经多种途径转移到颅内，其中以经血流途径转移最为常见，如肺癌主要经血流转移，易在颅内形成多发转移瘤。脑转移癌治疗可采用手术治疗，但转移瘤存在多发性，有时手术无法完全切除，尽管术后可辅助放射治疗(放疗)、化学治疗(化疗)，但患者仍存在复发率高、生存期短、5年生存率低等问题，导致其临床治疗效果不佳。双硫仑(disulfiram，DSF)也叫戒酒硫，是一种传统的戒酒药物，近年来有研究人员研究发现，双硫仑联合铜(DSF/Cu)还有抑制肿瘤的作用，能够杀伤包括黑色素瘤、直肠癌、肺癌、脑胶质瘤、乳腺癌等多种肿瘤细胞[1-3]。笔者在本研究旨在探讨DSF/Cu对肺癌脑转移癌细胞增殖和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试药 DSF(美国Sigma公司，批号：1110071)、铜盐(选用CuSO4/Cu2+)(美国Sigma公司，批号：20160302)，肺腺癌脑转移癌细胞(我院患者手术切除的标本)，细胞计数试剂盒-8( CCK-8) (Dojindo公司，批号：BB18011X)，达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)高糖培养基(批号：L401003)、小牛血清(FBS，批号：20170205)、二甲亚砜(DMSO，Sigma公司，批号：D0798)，细胞凋亡试剂盒(批号：20170408)、丙戊酸钠 (VPA，批号：20160509)均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.2仪器 流式细胞仪(Beckman公司，型号：FC500)，高速离心机(型号：3300，日本 Kubota公司)，紫外-可见分光光度计(Beckman公司)，细胞培养箱(Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 取肺腺癌脑转移癌手术后的新鲜离体标本，一部分送常规病理检查，剩余大小约1 cm×1 cm×1 cm的组织无菌包裹，送入无菌培养间培养。苏木精-伊红(HE)及免疫组化检查证明为肺腺癌脑转移癌的标本继续培养。标本的处理应用机械分散法分离细胞。用剪刀将瘤组织剪成碎块，并将组织碎块放在注射器内，反复推压后取出，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液。镜检细胞计数、接种培养。用上述分离方法得到的细胞，细胞悬液计数1×106·mL-1，肺腺癌脑转移癌细胞培养及分组细胞置于含10%FBS和100 U·mL-1青霉素-100 mg·mL-1链霉素的DMEM高糖培养基中，培养箱环境37 ℃、5%二氧化碳(CO2)、相对湿度95%，24 h更换培养液，待细胞覆盖瓶底>95%则用0.25%胰蛋白酶消化并传代。取对数生长期的肺腺癌脑转移癌细胞悬浮于含有10%DMSO、30%FBS和60%DMEM/F12的培养基中，保存在液态氮中备用。实验时将细胞分为空白对照组(不予任何药物)、VPA组(VPA 1.0 mmol·L-1)、DSF/Cu组(1，2，3，4，5 mg/0.17 mg)，每个浓度设4个复孔。将空白对照组、VPA组作为阴性对照。

1.2.2CCK-8法检测DSF/Cu对肺腺癌脑转移癌细胞增殖的影响 取备用细胞，解冻后置于上述培养基中，用血球计数板计数细胞密度，按5.0×104·mL-1种于96孔板中，孵育24 h，弃去旧的培养液，加入含FBS的新鲜培养液，每孔200 μL，再按上述分组分别加入相应浓度的药物，均培养72 h。弃去培养液，加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4，每孔100 μL)和CCK-8溶液(每孔10 μL)，于37 ℃避光孵化1 h，经酶标仪在波长480 nm检测每组各孔吸光度(A值)，依照公式计算细胞增殖抑制率，抑制率(%)=(1-试验孔A值)/对照孔A值×100%。

1.2.3Transwell小室检测DSF/Cu对肺腺癌脑转移癌细胞迁移的影响 用不含血清的DMEM培养液调整各组细胞密度为2.0×105·mL-1，上室加细胞悬液100 μL，下室加DMEM培养液(预先加10%FBS)600 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱孵育，24 h后弃上室培养液，取无水甲醇800μL室温固定30 min，棉签轻轻拭去底膜上室侧的细胞，用0.1%结晶紫染色15 min，于倒置显微镜下计数，取底膜下室侧左、右、中、上、下5处高倍视野(×400)的细胞总数，重复3次，并取平均值。

1.2.4Annexin V-PI双染色法检测DSF/Cu对肺腺癌脑转移癌细胞凋亡的影响 按试剂盒说明书操作，用不含EDTA的胰蛋白酶(0.25%)消化并收集各组细胞，冷PBS洗涤2次，缓冲液悬浮并调整细胞密度为1×106·mL-1，流式管加入细胞悬液100 μL，分别加入Annexin V 10 μL和碘化丙啶(PI)5 μL，混匀，常温避光反应15 min，1 h内经流式细胞仪检测，Ex=488 nm，Em=530 nm，计算总凋亡率。

2 结果

2.1CCK-8法检测DSF/Cu对肺腺癌脑转移癌细胞增殖的影响 随着DSF/Cu药物剂量不断增加，其对肺腺癌脑转移癌细胞增殖的抑制率明显加强，1 mg/0.17 mg组(29.68±3.12)%，2 mg/0.17 mg组(39.35±4.37)%，3 mg/0.17 mg组(58.84±5.15)%，4 mg/0.17 mg组(60.54±4.24)%，5 mg/0.17 mg组(81.21±6.36)%，空白对照组 (7.10±5.12)%，VPA组 (8.13±4.10)%，差异有统计学意义(P<0.01)，而且DSF/Cu对肺腺癌脑转移癌细胞增殖的抑制率与药物剂量呈剂量-效应关系。

2.2Transwell小室检测DSF/Cu对肺腺癌脑转移癌细胞迁移的影响 DSF/Cu药物处理肺腺癌脑转移癌细胞72 h后，各剂量组肺腺癌脑转移癌细胞的迁移能力受到明显的抑制(P<0.05或P<0.01)，而且DSF/Cu药物对肺腺癌脑转移癌细胞迁移的抑制能力具药物剂量依赖性，其中空白对照组迁移(42.3±1.6)个，VPA组(32.1±1.2)个，DSF/Cu1 mg/0.17 mg组(19.1±1.1)个，2 mg/0.17 mg组(11.5±1.8)个，3 mg/0.17 mg组(8.5±1.3)个，4 mg/0.17 mg组(6.3±1.3)个，5 mg/0.17 mg组 (3.3±1.6)个。见图1。

2.3Annexin V-PI双染色法检测DSF/Cu对肺腺癌脑转移癌细胞凋亡的影响 各剂量的DSF/Cu药物处理后肺腺癌脑转移癌细胞的凋亡率明显增加，VPA组(8.42±2.15)%，DSF/Cu 1 mg/0.17 mg组(11.24±1.34)%，2 mg/0.17 mg组(17.25±1.83)%，3 mg/0.17 mg组(25.67±1.66)%，4 mg/0.17 mg组(31.29±1.19)%，5 mg/0.17 mg组(45.12±1.13)%，与空白对照组 (6.98±1.31)%比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

3 讨论

双硫仑是一种传统的戒酒药物[9]，服用后即使饮用少量的酒，身体也会产生严重不适，而达到戒酒的目的。双硫仑安全，高效，毒性低，近年来有研究人员发现其有着广泛的抗肿瘤的作用，能够对包括肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、伯基特淋巴瘤等在内的多种肿瘤起到抑制和杀伤作用[10-12]。SKROTT等[13]研究表明双硫仑具有抗癌活性，并首次确定双硫仑的抑制癌症的具体机制：只有正常结构的蛋白质才能发挥其作用，如果细胞在合成蛋白质的过程中出现错误的表达以及其空间结构异常，细胞内的泛素蛋白酶系统，p97-NPL4通路就会激活，将异常的蛋白质降解，导致细胞的凋亡。而癌细胞比正常细胞增殖周期、蛋白合成更快，出现异常蛋白质概率也越大[14]，所以癌细胞的存活更加依赖P97-NPL4通路对合成蛋白质的调控，故此激活通路与多种癌症的生长转移密切相关[15-16]。在体内癌细胞会比正常细胞产生更多的铜离子[17]，而且双硫仑的代谢产物具有对癌细胞的特殊靶向性，会更多集中在癌细胞中与铜离子结合形成抗癌复合物，而这种活性复合物又与p97-NPL4通路中的NPL4蛋白结合，抑制其降解异常蛋白质的功能，从而导致癌细胞内功能异常蛋白的积累，最终诱导癌细胞的凋亡[13]。

从本文实验结果也可以看出，DSF/Cu对肺腺癌脑转移癌细胞的增殖及迁移起到抑制作用，同时能促进癌细胞的凋亡。由于癌细胞比正常细胞会产生更多铜离子，以及双硫仑对癌细胞的靶向性，可以推论出双硫仑对肺腺癌脑转移癌细胞有靶向抑制作用，其作用机制亦可能与癌细胞p97-NPL4通路被双硫仑抑制，导致肺腺癌脑转移癌细胞因细胞内功能异常蛋白质积累而凋亡有关。脑转移癌患者手术后需辅助放化疗，费用高，副作用大，患者痛苦不易接受，有些患者脑转移癌病灶较多无法完全手术切除，或者无法手术，亦或术后复发，既然本实验双硫仑对肺腺癌脑转移癌细胞有抑制作用，那么双硫仑对其他类型的脑转移癌是否也有一定的抗癌作用？具有一定的研究意义，将进一步研究双硫仑这种古老而且廉价的戒酒药抑制脑转移癌的抗癌机制，为其临床应用治疗脑转移癌提供更充足的理论依据，双硫仑有望成为联合治疗脑转移癌的新手段。

A.空白对照组；B.VPA组；C. 1 mg/0.17 mg组；D. 2 mg/0.17 mg组；E. 3 mg/0.17 mg组；F. 4 mg/0.17 mg组；G.5 mg/0.17 mg组

图1DSF/Cu对肺腺癌脑转移癌细胞迁移的影响

A.blank control group；B.VPA group；C. 1 mg/0.17 mg group；D.2 mg/0.17 mg group；E. 3 mg/0.17 mg group；F. 4 mg/0.17 mg group；G. 5 mg/0.17 mg group

Fig.1EffectofDSF/Cuonmigrationofbrainmetastasesfromlungcancer

A.空白对照组；B.VPA组；C. 1 mg/0.17 mg组；D. 2 mg/0.17 mg组；E. 3 mg/0.17 mg组；F. 4 mg/0.17 mg组；G.5 mg/0.17 mg组

图2DSF/Cu对肺腺癌脑转移癌细胞凋亡的影响

A.blank control group；B.VPA group；C. 1 mg/0.17 mg group；D.2 mg/0.17 mg group；E. 3 mg/0.17 mg group；F. 4 mg/0.17 mg group；G. 5 mg/0.17 mg group

Fig.2EffectofDSF/Cuonapoptosisofbrainmetastasesfromlungcancer