平菇高产漆酶和锰过氧化物酶液体培养条件的优化

黄 娇, 孙冬梅, 柯丽霞

(安徽师范大学 生命科学学院,重要生物资源保护与利用研究安徽省省级重点实验室，芜湖 241000)

白腐真菌是目前已发现的唯一能在纯系培养中高效降解木质素的一类微生物，具有降解范围广、降解能力强、营养要求低和固液基质的适应性强等优势，因此在处理染料废水等各种难降解污染物的应用中具有非常重要的作用[1-2]。白腐真菌可产生的胞外木质素降解酶系是降解木质素和染料等各种污染物的特殊酶系，包括木质素过氧化酶(lignin peroxidase,Lip)、锰过氧化酶(manganese peroxidase，MnP)和漆酶(laccase，Lac)[3]。平菇(Pleurotusostreatus)是一种较为常见的白腐真菌，其主要分泌漆酶和锰过氧化物酶两种木质素降解酶[4]。木质素降解酶活性的高低直接影响白腐真菌对木质素和有机污染物的降解效率，某些外源因子可提高白腐真菌分泌的木质素降解酶系活性[1,5]，采用平菇和酵母菌的混菌发酵体系亦可提高木质素降解酶系活性[6-7]。本文以油菜秸秆和豆渣为平菇液体培养的碳、氮源，首先研究了不同金属离子(Cu2+、Mn2+、Al3+、Zn2+和Fe3+，浓度均为0.5mmol/L)、不同浓度有机酸盐及吐温80对平菇分泌木质素降解酶系活性的影响，再以不同金属离子、不同浓度甘醇酸钠、不同浓度吐温80、不同酵母菌为因素进行正交实验，优化出平菇高产木质素降解酶系的液体培养条件，探索低培养成本下白腐真菌高产木质素降解酶系的培养方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种及材料 平菇(Pleurotusostreatus)为本实验室分离保藏备用。

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为本实验室分离保藏备用。

产朊假丝酵母(Candidautilis)和热带假丝酵母(Candidatropicalis)均购自中国农业科学院。

油菜秸秆：烘干粉碎过筛备用。

麦芽：购自青岛啤酒(芜湖)有限公司。

1.1.2 主要培养基 酵母菌液体培养基：麦芽汁液体培养基。

平菇液体菌种培养基：蔗糖糖蜜50g、蛋白胨2.5g、酵母浸膏2.5g、MgSO4·7H2O 1g、MnCl21g、KH2PO41g，蒸馏水定容至1000mL，pH6.0。

平菇液体发酵基础培养基：油菜秸秆粉30g、豆渣粉10g、KH2PO40.5g，MgSO40.5g蒸馏水定容至1000mL，pH自然。

以上所有培养基均121℃高压蒸汽灭菌20min。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种制备及液体培养方法 平菇液体菌种：将平菇斜面菌种接入到液体菌种培养基中，置于25℃、130r/min摇床振荡培养6d，为平菇一级菌种，再采用体积比10%的接种量转接到液体菌种培养基中，25℃、130r/min摇床振荡培养3d得到平菇二级菌种备用。

酵母菌液体菌种：在麦芽汁液体培养基中接入酵母菌菌种，在28℃、130r/min条件下摇床振荡培养18h。

液体培养优化试验时均使用平菇液体发酵基础培养基，菌种接种量均采用体积比10%。混菌培养时，平菇接种1天后再接入酵母菌菌种。25℃、130r/min振荡培养。

以上液体培养时均使用规格500mL锥形瓶，装液量为150mL。

1.2.2 粗酶液制备 每隔2d，定时吸取5mL发酵菌液，3000r/min离心15min，取上清液，即为粗酶液。

1.2.3 漆酶活性测定 采用分光光度计法[8]，取0.03mL粗酶液，依次加入3.4mL 0.1mol/L、pH4.0的醋酸钠缓冲液和0.5mL 3.34mmol/L邻联甲苯铵，置于40℃水浴反应5min。以煮沸酶液为对照，在600nm处测定反应最初3min内吸光度的增加值。酶活定义为在600nm处每分钟引起OD值增加0.1单位作为1个酶活力单位(U)。

1.2.4 锰过氧化物酶活性测定 采用愈创木酚法[9]，取粗酶液0.1mL，依次加入50mmol/L、pH4.5的琥珀酸钠缓冲液2mL，0.5mL 1.6mmol/L的硫酸锰和0.4mmol/L的愈创木酚0.8mL，同时加入0.2mL 0.1mmol/L的双氧水启动反应。以煮沸的酶液作对照，在30℃下预热5min后，测定反应最初3min内465nm处吸光度增加值。酶活定义为在465nm处每分钟引起OD值增加的0.01单位为一个酶活单位(U)。

1.3 数据处理

所有测定结果均设3个重复，结果取平均值±标准误，数据用SPSS21.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同金属离子对平菇液态发酵油菜秸秆分泌木质素酶系活性的影响

分别将浓度为0.5mmol/L的Cu2+、Mn2+、Al3+、Zn2+和Fe3+加入到基础培养基中，Lac和MnP的活性测定结果见图1、图2。在一定范围内，随着发酵时间的不断增加，Lac和MnP的活性呈上升趋势，在第8天时两种酶酶活均达到峰值。与对照相比，添加金属离子以后，Cu2+、Mn2+和Al3+均显著提高发酵体系中Lac和MnP的活性。Cu2+对Lac活性的提高幅度最大，为675U/L，比对照组高出226U/L；而Zn2+对漆酶活性有显著抑制作用；Mn2+对MnP的活性的促进作用最大，其活性是对照的2.03倍。

2.2 草酸钠和甘醇酸钠对平菇液态发酵油菜秸秆分泌木质素酶系活性的影响

在平菇液态发酵油菜秸秆培养体系中，草酸钠和甘醇酸钠对漆酶、锰过氧化物酶活性的影响见图3、图4。1mmol/L草酸钠和1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L甘醇酸钠对漆酶和锰过氧化物酶的活性有显著的促进作用。培养基中添加1mmol/L甘醇酸钠时，Lac的活性达617U/L，是对照的1.37倍；而1mmol/L草酸钠和3mmol/L甘醇酸钠分别对MnP活性有较好的促进作用，MnP活性分别是对照的2.09和2.0倍。

2.3 不同浓度吐温80对平菇液态发酵油菜秸秆分泌木质素酶系活性的影响

在平菇液态发酵油菜秸秆培养体系中，不同浓度的吐温80对漆酶、锰过氧化物酶活性的影响，见图5、图6。浓度为0.05%、0.1%和0.15%的吐温80对漆酶活性有显著的促进作用，而浓度为0.1%、0.15%和0.2%的吐温80对锰过氧化物酶的活性均有显著的促进作用。0.1%的吐温80对Lac和MnP的促进作用最大，其活性分别是对照的1.78和2.19倍。

图1 不同金属离子对平菇分泌漆酶活性的影响Fig.1 Effects of different metal ions on laccase production from P.ostreatus

图3 不同有机酸对平菇分泌漆酶活性的影响Fig.3 Effects of different organic acid on laccase production from P.ostreatus

图5 不同浓度的吐温80对平菇分泌漆酶活性的影响Fig.5 Effects of different concentration of tween 80 on laccase production from P.ostreatus

图2 不同金属离子对平菇分泌锰过氧化物酶活性的影响Fig.2 Effects of different metal ions on manganese peroxidase production from P.ostreatus

图4 不同有机酸对平菇分泌锰过氧化物酶活性的影响Fig.4 Effects of different organic acid on manganese peroxidase production rom P.ostreatus

图6 不同浓度的吐温80对平菇分泌锰过氧化物酶活性的影响Fig.6 Effects of different concentration of tween 80 on manganese peroxidase production by P.ostreatus

2.4 平菇液态发酵油菜秸秆分泌木质素酶系培养条件的优化

以上研究表明，Cu2+、Al3+、Mn2+、甘醇酸钠和吐温80对平菇产生木质素降解酶的促进作用较好，而先前的研究也表明，酿酒酵母、产朊假丝酵母和热带假丝酵母对平菇产生木质素降解酶的亦有促进作用，因此，以不同金属离子、不同浓度甘醇酸钠、不同浓度吐温80、不同酵母菌为实验因素设计四因素三水平正交实验L9(34)(表1)。

漆酶、锰过氧化物酶活，在第8天达到峰值，因此测定发酵8天的漆酶、锰过氧化物酶活性，结果见表2。由表2可知，平菇液态发酵油菜秸秆获得较高漆酶活性的适宜培养条件为：A1B2C1D2，即在平菇与产朊假丝

表1 正交实验因素水平表

酵母的混菌发酵体系中，加入0.5mmol/L Cu2+、3mmol/L甘醇酸钠及0.05%吐温80时，漆酶活性最高；各外源因子影响的主次顺序是：金属离子种类、吐温80浓度、酵母菌种类、甘醇酸钠浓度。平菇液态发酵油菜秸秆获得较高锰过氧化物酶活性的适宜培养条件为：A3B3C2D2，即在平菇与产朊假丝酵母混菌发酵体系中，加入0.5mmol/L Mn2+、5mmol/L甘醇酸钠及0.1%吐温80。各影响因子的主次顺序是：金属离子种类、酵母菌种类、甘醇酸钠浓度和吐温80浓度。

表2 正交试验结果及极差分析

以平菇发酵基础培养基为对照，根据正交实验结果得出的最优水平组合分别配制培养基发酵。结果如表3：最优培养条件下，漆酶的活性为851.4U/L，锰过氧化物酶活性为478.3U/L。

3 讨论

白腐真菌能对木质素和许多异生物质，包括环境中难以处理的污染物进行降解,因而白腐真菌在环境保护与治理方面有较好的应用前景[10]。其降解主要依赖自身分泌的木质素降解酶系，它主要包括漆酶(Lac)、锰过氧化物酶(MnP)和木质素过氧化物酶(Lip)。白腐真菌分泌木质素降解酶系一般发生在次生代谢阶段，且只有在生长环境中碳、氮等主要营养物质受限制时才能形成[11]。有关限碳和限氮下木质素降解酶系产生的研究已有较多报道[12]。一些研究发现，某些外源物质能促进白腐真菌产生木质素降解酶系，如金属离子，草酸，吐温80等，但在油菜秸秆和豆渣为主要营养的深层培养中，特别是有关提高木质素降解酶系活性的优化培养条件的研究还少见报道。

李慧蓉等在研究黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)中发现接种低浓度(0.1～1mmol/L)金属离子时会促进其生长[12]，所以本研究中金属离子选择0.5mmol/L。有关不同外源因子对白腐真菌分泌的Lac和MnP活性的影响已有不少报道。张丁倩等[13]对灵芝和产朊假丝酵母混菌固态发酵油菜秸秆的研究表明添加1mmol/L的Cu2+，可显著提高漆酶和锰过氧化物酶的酶活力，添加1.5、2和2.5mmol/L铜离子时对木质素过氧化物酶有抑制作用。Shankar and Nill[1]的研究表明，金属离子(Mg2+、Co2+、Ca2+和Cu2+)能不同程度地增强Lac的活性，1.6μmol/L～1.5mmol/L的CuSO4·5H2O不影响白腐真菌-硬毛栓菌(Tametestrogii)的生长，但大幅度提高Lac和MnP的活性[14]。Cu2+、Mn2+、Al3+可显著提高白腐菌产生的Lac和MnP的活性，而较高浓度又会起到抑制作用[15-18]。促进作用在不同的研究中不尽相同，可能的原因是所使用的金属离子浓度不同或是培养的基质不同引起的差异。本研究中，Cu2+、Mn2+、Al3+都可显著提高平菇产Lac和MnP的活性，Zn2+对漆酶活性则有显著抑制作用。有研究发现[13,17]，添加2、4mmol/L草酸钠可显著提高Lac活力，添加4mmol/L草酸钠可显著提高MnP的活力，3mmol/L的甘醇酸根对平菇分泌MnP的促进作用最大。本研究发现1mmol/L草酸钠和3mmol/L甘醇酸钠对MnP活性有较好的促进作用。已有报道吐温80能提高Lac和MnP的酶活，不同浓度的吐温80影响效果不同[19-21]。本研究发现0.1%的吐温80对Lac和MnP的促进作用最大，其活性分别是对照的1.78倍和2.19倍。本研究中，优化后的培养基其平菇分泌的Lac和MnP活性分别是未优化的1.89倍和2.245倍，Lac和MnP活性增产效果明显。

表3 优化液体培养下平菇分泌的漆酶和锰过氧化物酶活性

注：表示与对照相比具有显著性差异(p<0.05)

Note:indicates significant difference from the control (p<0.05)

不同的研究表明，平菇分泌Lac和MnP活性到达峰值的时间不同。Ding[22]研究了白腐真菌固态发酵玉米秸秆，其中平菇在发酵第20天时，MnP活力达到最高；而本研究在第8天酶活就达到峰值。可能原因是液体培养基比固态培养基对底物的利用更高效些。宋丽丽[23]等研究发现硬毛粗盖孔菌(Funaliatrogii)优化液体培养至第8天时，漆酶活性达到峰值，与本研究酶活达到峰值时间相同。吴佳琳[24]研究表明，当发酵到第7天时，木质素降解酶系活性达到峰值，与本研究结果存在差异；可能由于发酵底物存在差异或不同的白腐真菌达到峰值的时间不同。

白腐菌与酵母菌混菌发酵可显著提高白腐菌木质素降解酶的活性[6-7]。产朊假丝酵母也产生一定水平的锰过氧化物酶[25]，所以平菇和产朊假丝酵母混菌发酵较平菇单菌发酵酶活性高。另外酵母菌在生长代谢过程中可能形成一些营养物质，有助于提高发酵体系中Lac和MnP的活性[26]。

本研究利用油菜秸秆和豆渣作为白腐真菌——平菇的主要营养基质，以达到废物利用、降低成本的目的。以往的研究中，对白腐真菌的培养大多采用传统的培养基，其成分以化学药剂和粮食为主。虽然实验室条件下培养基原料用量少，但在大规模的工业废水处理中，其用量和成本不可忽略。稻草、麦秆、玉米秸秆、油菜秸秆、玉米芯等农作物秸秆类物质是一种潜在的非竞争资源，目前只有少量秸秆低值应用，大部分被当作废弃物处理，如焚烧等，对环境造成污染。利用白腐真菌发酵油菜秸秆获得木质素降解酶系，不仅降低了培养成本，也为秸秆的利用提供了新的途径。Afrida[27]等利用相思木木屑等农业和森林废弃物作为白腐真菌的培养基，利用白腐真菌产生的木质素降解酶对相思树属牛皮纸浆进行氧化脱木质素的生物漂白，效果良好。所以，秸秆类作为白腐真菌生产木质素降解酶的培养基质有着巨大潜在的应用前景。