神经束蛋白155高表达少突胶质细胞模型的构建

胡斌，王成举，陈鹏慧，张雨平

(1 陆军军医大学第二附属医院，重庆400037；2 陆军军医大学基础医学院)

脑白质损伤是早产儿特有的脑损伤形式之一。最严重的结局是早产儿脑室旁白质软化,会造成脑瘫、视听功能异常、认知障碍等神经系统后遗症。目前脑白质损伤的具体发生机制尚不明确。神经束蛋白155(neurofascin155，NF155)主要存在于胶质细胞中，是神经束蛋白(neurofascin，NF)家族成员之一，在中枢神经系统主要表达于少突胶质细胞及其前体细胞中[1]。NF155的表达始于髓鞘形成初期，在整个髓鞘形成期间持续高表达，随着少突胶质细胞的发育逐渐成熟，NF155从胞体向细胞突起末端迁移，最终分布于成熟中枢神经系统的髓鞘结侧区脂筏中[2]。研究[3,4]发现，NF155在髓鞘形成及损伤后的修复过程中起到重要作用，并且与多种自身免疫性脱髓鞘疾病中的髓鞘病变相关。我们前期研究[5]发现，缺氧缺血脑白质损伤早产模型大鼠脑组织中髓鞘量减少、轴突萎缩导致神经功能异常，与NF155的表达缺失有关，在缺氧缺血损伤早期补充NF155，很可能对脑白质损伤具有预防甚至修复作用。因此，NF155有可能成为脑白质损伤干预治疗的一个新靶点。为此，2017年9月～2018年1月，我们构建了NF155高表达的少突胶质细胞模型，并验证NF155的表达情况，为进一步研究NF155在髓鞘损伤及修复中的作用和机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒、pUM-T simple vector克隆试剂盒、2×Taq PCR MasterMix购自BioTeke公司；PCR试剂盒、PCR产物回收试剂盒、β-actin购自碧云天生物技术研究所；NheⅠ、AgeⅠ限制性内切酶购自Fermetas公司；NF155抗体购自CST公司；细胞培养DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；少突胶质细胞由本课题组取新生大鼠大脑皮层原代培养，新生SD大鼠购自陆军军医大学实验动物中心；感受态细菌E.colin DH5α、T4连接酶为实验室留存；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 NF155慢病毒载体质粒构建

1.2.1 目的基因及引物设计合成 从NCBI GenBank数据库获取NF155的DNA序列，引物序列设计如下，NF155上游引物5′-CAAGCTAGCATGGCCAGGCAGCAGGCGCCA-3′，NF155下游引物5′-CGCACCGGTTCAGGCCAGGGAATAGATGGC-3′，下划线部分分别为NheⅠ、AgeⅠ限制性内切酶酶切位点。以目的片段为模板进行PCR扩增，反应体系如下，NF155上游引物和NF155下游引物各取1 μL，模板2 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，用ddH2O补足至20 μL；反应条件如下，95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s 30个循环，72 ℃延伸5 min。

1.2.2 NF155慢病毒载体质粒的构建及鉴定 取NheⅠ、AgeⅠ双酶切PCR产物和pUM-T simple vector克隆载体，用1 %琼脂糖凝胶回收酶切产物，连接目的片段和载体片段，反应体系如下，载体片段1 μL，目的片段1 μL，T4 连接酶1 μL，buffer 5 μL，加ddH2O补足至10 μL；反应条件为22 ℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37 ℃培养20 h。挑选单克隆菌落接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃摇床震荡培养过夜。抽提质粒送沈阳万类生物科技有限公司测序。 NF155慢病毒载体质粒经NheⅠ、AgeⅠ双酶切，1 %琼脂糖凝胶电泳后可见两条3 723、8 083 bp的片段，表明NF155与pUM-T simple载体连接成功。经沈阳万类生物科技有限公司测序，与GeneBank中NF155的基因序列一致，表明NF155慢病毒载体质粒构建成功。

1.3 NF155慢病毒载体质粒转染的少突胶质细胞NF155 mRNA及蛋白检测

1.3.1 少突胶质细胞分组及NF155慢病毒载体质粒转染方法 取对数生长期少突胶质细胞接种于6孔板中，用不含抗生素的无血清培养基于37 ℃、5 % CO2的孵箱中培养24 h。将细胞分为空白对照组、阴性慢病毒感染组、NF155慢病毒感染组。空白对照组不做任何处理，阴性慢病毒感染组给予10 μL空载体慢病毒+100 μL培养基，NF155慢病毒感染组给予10 μL慢病毒载体质粒+100 μL培养基。37 ℃、5 % CO2条件继续培养12 h。

1.3.2 三组细胞NF155 mRNA检测 采用荧光定量PCR法。取转染后的少突胶质细胞提取总RNA，反转录合成cDNA，然后进行PCR扩增。反应体系如下，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，SYBR Green 0.3 μL，用ddH2O补足至20 μL；反应条件如下，94 ℃预变性5 min，94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s 40个循环，72 ℃ 150 s，40 ℃ 90 s，60 ℃-94 ℃每1 ℃ 1 s，25 ℃ 120 s。以2-ΔΔCt代表CG5844基因的相对表达量，重复3次，取平均值。

1.3.3 三组细胞NF155蛋白检测 采用Western blotting法。收集转染72 h后的细胞时，先用预冷的PBS缓冲液清洗三次，加入含0.4 %蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰浴30 min后用细胞刮轻轻刮下细胞，移至离心管中，于4 ℃、14 000 r/min离心15 min收集上清。加入0.2倍体积的6×上样buffer，100 ℃沸水煮5 min，上样于SDS-PAGE。经电泳、转膜后于5 %脱脂牛奶中封闭2 h。滴加相应的NF155抗体、β-actin抗体，4 ℃摇床孵育过夜。然后，用TBST清洗8 min×3次后，滴加辣根过氧化酶标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG，室温孵育1 h。用TBST清洗8 min×3次后，将发光液A液和B液按1∶1混合均匀后滴加于PVDF膜表面，Quantity One曝光。以目的条带灰度值与β-actin灰度值代表NF155蛋白的相对表达量，重复3次，取平均值。

2 结果

NF155慢病毒感染组、空白对照组、阴性慢病毒感染组NF155 mRNA相对表达量分别为3.25±0.11、1.00±0.06、1.08±0.01，与空白对照组、阴性慢病毒感染组比较，NF155慢病毒感染组NF155 mRNA相对表达量升高(P均<0.05)。

NF155慢病毒感染组、空白对照组、阴性慢病毒感染组NF155 蛋白相对表达量分别为1.57±0.08、0.51±0.12、0.50±0.06，与空白对照组、阴性慢病毒感染组比较，NF155慢病毒感染组NF155蛋白相对表达量升高(P均<0.05)。

3 讨论

神经元轴突的髓鞘化完成标志着神经发育成熟。髓鞘的生理功能主要体现在对神经元轴突的保护和绝缘作用，并在此基础上确保神经冲动通过跳跃式传导而高速传递[6]。然而在脑白质损伤中，由于髓鞘损伤或发育不良，使其生理功能完全或部分丧失，导致一系列病理生理改变。脑白质损伤引起的神经纤维脱髓鞘包括了原发性脱髓鞘和继发性脱髓鞘，诸如多发性硬化(multiple sclerosis，MS)和脑白质营养不良的原发性脱髓鞘病变多由免疫介导的变态反应或因遗传因素所引起；而继发性脱髓鞘病变则是由于感染、中毒、外伤、肿瘤等因素所引起；这些病变的发生与髓鞘的稳定性、抗原性等特性密切相关，而主要取决于髓鞘结构中的一些重要的黏附分子[7～9]。

神经束蛋白是Rathjen等[10]1987年在鸡的体内发现的一种参与神经束形成的细胞表面蛋白，其结构包括6个Ig结构域、5个NFIII样结构域、1个跨膜结构域和1个胞质结构域，这种结构与免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员极其相似，如神经细胞黏附分子L1和类L1同源物、NgCAM相关黏附分子(NrCAM)[11]。目前在人类和各类动物的神经系统中，发现有NF140、NF155、NF166、NF180和NF186等5种不同的神经束蛋白多肽类型[12,13]，它们的表达受到时间和空间的调控，既可在胚胎或成体中表达，又可在神经元或胶质细胞中表达，或独立、或与细胞内外不同的蛋白相互作用影响着不同的细胞进程[14]。NF166和NF180都只在未成熟的神经元中表达，主要功能是选择性地调节神经轴突的生长，Lustig等[15]研究证明NF166和NF180在轴突起始段和郎飞结处高度富集，联合Na+通道，共同作用于轴突电位和信号传导的启动过程；随着大脑发育的成熟，NF186的表达逐渐占据主导地位，其功能主要是通过干扰并减少轴突起始段的突触数量而使神经元保持稳定，Feinberg等[16]的研究表明NF186作用于Na+通道无髓鞘节段的β1和β3亚基聚集处，直接影响髓鞘郎飞结结侧区的信号传导，在神经纤维的神经胶质和神经元跳跃式传导过程中发挥着独特作用；NF140是2017年Dolmont等在慢性炎性脱髓鞘神经病(CIDP)患者血清中新发现的一种神经束蛋白多肽亚型，其结构与生物学功能尚待进一步的研究[12]；本研究构建的神经束蛋白多肽亚型NF155，在结构方面通过微外显子的排他表达区别于其他神经束蛋白亚型[17]。NF155的生物学功能一方面表现在轴突起始段的形成早期发挥着重要的作用，Pomicter等[18]研究发现NF155表达缺失可造成轴突起始段形成障碍而导致小鼠表现出明显的共济失调和神经传导速度下降；另一方面，NF155在髓鞘结构的形成和损伤后的修复过程中起到关键作用，Sherman等[19]研究发现NF155能招募和聚集caspr、contactin，在结侧区形成复合物维持髓鞘结构的稳定，在caspr-/-和contactin-/-小鼠中，NF155尚且能在结侧区聚集，但在NF155-/-小鼠中，尽管caspr和contactin总量未减少，但却无法聚集于结侧区；Mathey等[20]研究亦发现NF155对髓鞘损伤后的修复功能可以作为治疗自身抗体介导的轴突损伤新靶点。NF155在中枢神经系统髓鞘的发育、稳定及修复中均发挥着重要作用。

随着分子生物学技术的发展，目前应用于目的基因转染的病毒载体主要包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒载体[21]。慢病毒载体是逆转录病毒的一个亚型，它有着更广泛的宿主，对分裂期及非分裂期细胞均具有感染能力，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞，可极大提高目的基因的转染效率，且载体容量大，可携带并整合进入宿主细胞的目的基因对抗转录沉默作用，在靶细胞中得到持续高效稳定的表达，此外慢病毒载体中还可以插入组织细胞特异性的启动子和增强子，提高转入基因的转录靶向性，使慢病毒载体中的目的基因在特定的组织细胞中表达，基于上述诸多优点，慢病毒载体被广泛应用于细胞生物学、分子生物学以及疾病的基因治疗等方面的研究中[22]。

本研究成功构建了NF155慢病毒表达载体，经过酶切鉴定达到预期效果。为了进一步验证构建的NF155慢病毒表达载体在过表达NF155方面的有效性，我们用重组的NF155慢病毒表达载体感染了少突胶质细胞，相较于空白对照组和阴性慢病毒感染组，NF155慢病毒感染组细胞中NF155 mRNA及其蛋白表达量均增高，进一步证实NF155高表达瞬转细胞模型的成功建立。这一研究结果将为进一步研究NF155对脑白质损伤髓鞘形成及损伤修复等病理生理过程的影响，探究NF155在脑白质损伤髓鞘形成及修复中的作用和机制奠定了实验基础。