梅毒螺旋体重组蛋白在血清学诊断中应用的研究进展

邓毅，雷鸣，赵飞骏，张晓红

(1 南华大学病原生物研究所，湖南衡阳421001；2 南华大学附属常德市第一人民医院)

梅毒是一种可累及人体多器官系统的性传播疾病，其病程长、临床表现复杂多变，严重危害人类健康。其病原体为密螺旋体属苍白密螺旋体苍白亚种，俗称梅毒螺旋体(Tp)。尽管有研究者对其在体外以棉尾兔细胞做载体进行了培养，但仍未真正实现Tp的体外人工培养繁殖，极大限制了相关的基础与临床研究[1]。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，在重组膜脂蛋白、表面蛋白基础上，许多新的梅毒重组蛋白[2]如感染依赖性抗原、假定蛋白、黏附相关蛋白及鞭毛蛋白等，都被纳入梅毒血清学诊断的候选蛋白进行了相应评价。现对这些蛋白在血清学诊断方面的应用综述如下。

1 Tp感染依赖性抗原及假定蛋白

活的Tp在感染阶段时，可能新合成分泌了一些抗原到菌体内外或胞质；这类抗原可通过调控宿主细胞信号转导通路，介导Tp与宿主细胞间的相互作用，在梅毒感染早期的炎症反应以及在宿主体内持续慢性感染过程中发挥重要作用，因此被称为Tp感染依赖性抗原[3]。

1.1 Tp0971、Tp0768、Tp0462 Tp0971基因全长615 bp,可编码305个氨基酸，蛋白晶体结构分析显示其可能是一种周质膜脂蛋白，具有乳铁蛋白结合特性和金属离子稳态作用[4, 5]。张跃军等[6]研究发现，Tp0971膜脂蛋白能刺激THP-1细胞转化的巨噬细胞分泌大量前炎症细胞因子IL-6、IL-1β，且这些细胞因子的分泌水平与Tp0971浓度呈一定剂量依赖关系。McKevitt等[7]研究显示，被Tp感染后第7、14、28、56、84 d的新西兰兔血清能识别重组GST-Tp0971融合蛋白,提示Tp0971在梅毒感染的诊断中有潜在价值。Brinkman等[8]研究发现，重组GST-Tp0971融合蛋白也与早期、二期和潜伏早期梅毒患者血清有较强的免疫反应性。曾铁兵等[9]以重组蛋白Tp0971为已知抗原建立间接ELISA法，并与TPPA法进行了比较，结果显示rTp0971-ELISA的特异性为100%、敏感性为89.1%、总符合率为92.7%，但其检出率低于TPPA法 。

Tp0768又名TmpA抗原，可编码345个氨基酸，相对分子质量约37 kDa，是Tp的一种质膜蛋白。Liu等[3]利用基因工程技术在原核表达系统中成功地表达和纯化获得了高纯度的Tp0768重组蛋白，经免疫印迹鉴定，重组蛋白Tp0768能被梅毒患者阳性血清所识别,具有良好的抗原性,可以作为一种梅毒诊断抗原。同时，他们在筛选梅毒诊断抗原的过程中发现，Tp0768也具有感染依赖性抗原的特点，并与新西兰兔血清和临床患者的血清标本具有较好的免疫反应性。

Tp0462可编码392个氨基酸，相对分子质量约40 kDa，属于Tp013X家族，是一种目前功能未知的假定蛋白。经生物信息学分析，推测Tp0462具有信号肽，有可能是一种具有多个抗原表位区的分泌蛋白。刘文等[10]通过基因工程技术成功构建了pET43.1a/Tp0462重组质粒，并将其表达于大肠杆菌中，经免疫印迹鉴定，Tp0462与梅毒阳性血清发生免疫反应，而与梅毒阴性血清不反应。在后续的相关实验中，他们以重组蛋白Tp0462为基础建立间接ELISA法；结果显示，基于Tp0462蛋白建立的ELISA检测结果的灵敏度为97.0%、特异性为98.8%、ROC曲线下面积(AUC)为0.997，提示该蛋白具有较高的临床诊断价值。通过动物实验筛选Tp感染依赖性抗原时发现，活Tp接种组新西兰兔诱导产生的抗体总水平与灭活Tp接种组并无显著差异，但前者血清中检测到有较高滴度的抗Tp0462特异性抗体，是一种非菌体膜蛋白，而后者血清中并无相关抗体,从而认为Tp0462是符合感染依赖性抗原特点的候选抗原蛋白之一。

在进一步的研究中[3]，分别以单一的Tp0971、Tp0768及Tp0462蛋白为包被抗原建立间接Tp-ELISA法，检测了2 138份梅毒血清标本，评价其在梅毒血清诊断学中的价值。研究结果显示，与TPPA法相比较，基于Tp0971、Tp0768、Tp0462建立的ELISA检测结果的敏感性和特异性分别为97.6%、96.6%和97.0%、95.2%和91.7%、98.8%，前者显示出较高的灵敏度和良好的特异性；经ROC曲线分析，AUC分别为0.983、0.990和0.997，亦说明这3个蛋白均可以作为梅毒的诊断抗原使用；同时研究发现，Tp0971、Tp0768在一期梅毒和隐性梅毒检测中的阳性检出率分别为97%、95%和94%、96%，提示Tp0971、Tp0768在早期感染和潜伏感染诊断中有重要的意义。

1.2 Tp0134、Tp0470 Tp0134是一种编码376个氨基酸，相对分子质量约40 kDa，与Tp0136、Tp0462等属于同一家族的Tp假定蛋白。黄作良等[11]分析发现，Tp0134具有信号肽，可能是一种分泌蛋白，且具有多个抗原表位区。进一步研究发现，Tp0134具有感染依赖性抗原的特点，由于这类抗原和以往发现的梅毒诊断抗原存在一定的差异，故两者的诊断性能也可能有着各自不同的特点。在后续相关实验中，他们以Tp0134抗原包被液建立rTp0134-ELISA，检测了468份临床各期梅毒血清，其灵敏度为97.19%、特异性为96.85%；ROC曲线分析，AUC为0.911，提示Tp0134具有良好的抗原性，且具有较高的诊断价值，可以作为梅毒血清检测的候选诊断抗原。

Tp0470全长1 110 bp，蛋白相对相对分子质量约40.7 kDa，是一种目前功能尚未知的TP假定蛋白。黄作良等[11]通过生物信息学及蛋白结构分析推测，Tp0470可能有信号肽，具有分泌蛋白的一些基本特性。由于Tp0470与活Tp感染后和灭活Tp接种后新西兰兔血清反应性存在显著差异，从而初步证实Tp0470是一种感染依赖性抗原。他们以Tp0470蛋白为包被抗原建立间接ELISA法，检测了468份临床各类血清，结果显示，基于Tp0470蛋白建立的ELISA检测结果的灵敏度为95.32%、特异性为95.66%，ROC曲线分析进一步提示Tp0470作为梅毒诊断靶标抗原的潜质。

1.3 Tp0693 Tp0693是一种可能存在于在Tp的外膜，结构及功能尚不明确的假定蛋白，相对分子质量约为50 kDa。生物信息学分析发现，TP0693具有信号肽和多个抗原表位，可能属于外分泌蛋白。研究发现，Tp0693蛋白在各Tp致病菌株中均能稳定表达，与其他病原菌蛋白和人体自身蛋白同源性低。Zhang等[12]通过基因工程技术成功构建了pET30a/Tp0693 重组质粒，经免疫印迹鉴定，重组蛋白Tp0693与梅毒阳性血清有特异性免疫反应，具有良好的抗原性。在后续相关实验中，以重组蛋白Tp0693为包被抗原建立间接ELISA法，检测了201份各期梅毒血清标本、66份交叉血清标本和100份阴性血清标本。研究结果显示，Tp0693与正常人血清和交叉血清不反应，而与各期梅毒患者血清可发生较强的免疫反应，提示该抗原有良好的特异性。基于重组Tp0693建立的间接ELISA方法特异性为100%、敏感性为91%,与金标准TPPA结果符合率高,但阳性结果的S/CO值与RPR滴度无相关性。经ROC曲线分析，AUC为0.990，提示Tp0693具有潜在的临床诊断价值。

2 Tp黏附蛋白

黏附介导的微生物定植在病原微生物感染的起始阶段发挥重要作用。Tp具有黏附到细胞外基质纤连蛋白的能力，能黏附到宿主多个组织器官，导致全身性播散。

2.1 Tp0155和Tp0483 Tp0155基因全长1 116 bp，编码371个氨基酸。Bamford等[13]研究认为，Tp0155是一种包含前导肽、2个N端LysM结构域和M23肽酶序列的蛋白质，其中两个N端LysM结构域可识别碳水化合物的聚合体，M23肽酶序列则能降解肽聚糖并显示出酶活性。Tp0155和Tp0483是细胞外基质纤连蛋白的结合蛋白，两者都能与纤连蛋白特异性结合。Tp0155优先与纤连蛋白的基质形式结合，而Tp0483则能同时与纤连蛋白的可溶性和基质形式结合，它们以不同的构象形式存在，在纤连蛋白基质组装过程中，可暴露出隐藏表位。通过对Tp0483外膜蛋白的分析，Dickerson等[14]发现了在274～289和316～333氨基酸残基之间有2个纤连蛋白结合区域。然而，Van Voorhis等[15]研究发现，基于rTp0155和rTp0483建立的ELISA方法检测梅毒患者血清的总灵敏度均较低，分别为28%、42%。他们同时发现，这两种蛋白仅在9%的梅毒患者血清出现阳性结果，而且这些阳性反应性血清均来自早期原发性感染的个体。

2.2 Tp0136 Tp0136全长1 488 bp，编码495个氨基酸，相对分子质量为50 kDa，位于Tp外膜上。Brinkman等[16]发现，附着在宿主细胞外基质上的Tp0136具有结合纤连蛋白和层粘连蛋白的能力。最近的研究表明[17]，Tp0136通过其N端保守区能有效地黏附于细胞，甚至比血浆纤维连接蛋白的作用更为有效。在模拟感染试验中，宿主对病原体的免疫应答的同时，Tp0136被高度转录，表明该蛋白可能在Tp的持久性免疫中发挥作用。同时，Brinkman等[16]发现，在Tp各亚种及菌株之间，Tp0136基因的开放阅读框均存在不同程度的变异；依据基因的异质性，Tp0136可分SS14 和非SS14两种亚型。这种分子生物学的分型方法既能提高基因分型的效率，又能用于Tp菌株的鉴别，对于区分梅毒的临床分期、了解病情进展、判断预后和治疗方案的选择均具有重要意义。因此，Tp0136的蛋白异质性对于梅毒的血清学诊断和预后判断具有重要的临床应用价值。

3 Tp鞭毛蛋白

鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要成分，是Tp菌体蛋白质的重要组成部分，对Tp在宿主体内的入侵和传播具有重要意义。此外，Tp鞭毛蛋白作为一种经典的病原相关分子模式，能触发固有免疫应答和适应性免疫应答。因此，这些蛋白被认为是疫苗以及免疫治疗的有效佐剂。

3.1 Tp0463 Tp0463是新近发现的一种含110个氨基酸的Tp鞭毛蛋白。生物学信息分析表明，Tp0463含有数个较强的B细胞表位，因而推测其可能具有较强的抗原性和免疫原性。McKevitt等[7]研究表明，Tp0463重组蛋白能与各期Tp感染兔混合血清发生很强的免疫反应，而与正常兔血清不发生免疫反应，提示该抗原具有较高的特异性和敏感性。刘小军[18]通过基因工程技术成功构建了pET28a+/Tp0463重组质粒，经免疫印迹鉴定，重组蛋白Tp0463与梅毒阳性血清有特异性免疫反应，具有良好的抗原性，而与梅毒阴性血清则不发生免疫反应。在后续实验中，他们以Tp0463重组蛋白为诊断抗原建立的间接ELISA检测各期梅毒患者以及健康对照人群共340份临床血清标本；结果显示，基于Tp0463蛋白建立的ELISA检测结果的总灵敏度为87.7%、特异性为100%，其灵敏度低于TPPA法，差异有统计学意义，两种方法总符合率为 95.0%。Jiang等[19]研究结果表明，鞭毛蛋白Tp0463对原发性和先天性梅毒IgM抗体的检测表现出良好的检测性能，其敏感性为92.6%、特异性97.9%、阳性预测值为99.4%、阴性预测值为77.5%。由此认为，Tp0463可作为一种新的梅毒筛查诊断标记物且对疫苗的研制具有极其重要的意义。

3.2 Tp0868、Tp0792、Tp0870 Tp0868(FlaB1，34.5 kDa)、Tp0792(FlaB2，33 kDa)和 Tp0870(FlaB3，31 kDa)以及包裹在核心蛋白外的鞘蛋白 Tp0249(FlaA)是具有代表性的鞭毛蛋白，这些蛋白促成了Tp独特的螺旋状运动方式。McGill等[20]发现，Tp0868、Tp0792和Tp0870和鞭毛动力蛋白Tp0400在梅毒的各个阶段均具有强烈的血清反应性。对重组鞭毛蛋白的筛选显示，FlaB1、FlaB2、FlaB3对IgG抗体的整体敏感性和特异性较高，分别为95.4%、98.9%和92.6%、95.8%和95.1%和95.8%。此外，FlaB1、FlaB2、FlaB3蛋白在原发性和先天性梅毒IgM抗体检测中均表现出较好的灵敏度和特异性，其敏感性和特异性分别为76.8%、83.1%和72.0%、87.7%和74.4%、89.2%[19]。因此，FlaB1、FlaB2和FlaB3蛋白被纳入梅毒血清诊断的候选新抗原组。

4 Tp膜脂蛋白

Tp膜脂蛋白多位于细胞内膜层，在Tp致病过程中与宿主黏附、定植、播散以及激发机体免疫反应密切相关，可能为Tp的主要致病因子；同时，Tp膜脂蛋白也是梅毒血清学诊断的敏感特异性指标。

4.1 Tp0821 Tp0821是近年来发现的一种基因全长807 bp，编码268个氨基酸的位于细胞外膜的TP膜脂蛋白。Tp0821的晶体结构与胞质配体结合蛋白类似，与蛋氨酸转运蛋白家族具有同源性，可能参与Tp蛋氨酸转运。以Tp0821为诊断抗原建立的ELISA试验结果显示，IgM和IgG的相对阳性率分别为91.0%、98.3%。对30例莱姆病患者、5例钩端螺旋体病患者和52例未感染者对照血清样本进行交叉试验时，其特异性分别为94.3%、100%，基于Tp0821的ELISA试验与临床常用的TPPA和化学发光免疫检测(CIA)的结果具有良好的相关性[21]。这些实验数据表明，Tp0821可作为梅毒血清学诊断的一种新的候选抗原，但是否能应用于临床诊断需要进一步的验证和确认。

4.2 Tp15、Tp17、Tp47 Tp15在内膜中含量相对较少，其基因全长426 bp,相对分子质量为15 kDa。米希婷[22]采用重组抗原Tp15、Tp17、Tp47对各期梅毒患者进行体液免疫反应的检测，Tp15在各期梅毒中阳性检出率相对较低(仅为64.7%)，表明其引起的早期体液免疫反应是有限的。但Tp15在血清固定型梅毒患者中表达明显增强，其有可能是造成梅毒患者血清固定的因素之一。Tp17蛋白抗原在内膜中含量丰富，其基因全长468 bp,相对分子质量为17 kDa。米希婷[22]研究发现，与正常对照组相比较，各期梅毒对Tp17的免疫反应均有统计学差异，Tp17的阳性检出率为100%，是阳性反应最高的抗原,提示Tp17是Tp中免疫原性较强的一种膜脂蛋白。Tp47膜脂蛋白在Tp膜蛋白中含量较高，其基因全长1 302 bp，相对分子质量为47 kDa。它可刺激血管内皮细胞合成细胞间黏附分子，并诱导病原体与细胞间的黏附。Lee等[23]的研究发现，Tp47能促进细胞黏附分子如血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E选择素等在皮肤微血管内皮细胞上的表达，从而调节T淋巴细胞结合人皮肤微血管内皮细胞，继而黏附侵入宿主，并刺激免疫细胞产生免疫应答。

Tp15、Tp17、Tp47是重要的Tp膜脂蛋白，这些抗原已经成功地应用于梅毒血清学诊断试验的建立，并在临床上广泛使用。早期梅毒的血清学诊断是基于单个重组抗原。Tp15、Tp17、Tp47独立诊断的敏感性和特异性分别为100%、96%和100%、100%和100%、20%，2种或3种抗原的联合检测则可提高诊断的准确性[24]。目前，以TpN15-TpN17-TpN47重组蛋白嵌合抗原建立的 Tp-ELISA能有效降低假阳性率和假阴性率，有着更高的灵敏度、特异度和符合率。

5 Tp表面蛋白

Tp表面蛋白位于菌体外膜，与其他革兰阴性细菌相比，Tp外膜上表面蛋白种类稀少。因最先暴露于免疫系统，表面蛋白是完整的Tp菌体中最重要的免疫靶点，同时在Tp的毒力中也发挥重要作用[25]。

5.1 Tp0326(Tp92) Tp0326基因全长2 562 bp，编码853个氨基酸，相对分子质量为96 kDa，是目前已知的Tp外膜蛋白中惟一与革兰阴性菌外膜蛋白具有序列同源性的蛋白。Tp0326 N端有5个多肽转运相关结构域，C端有1个由18个β-折叠形成的具有双亲性的β-桶样结构。Luthra等[26]研究显示，在Tp细胞膜表面，含有大量桶形结构的外膜蛋白形成亲水性的化学通道，便于营养物质进入细胞，同时排出代谢产物，从而满足其自身新陈代谢及繁殖的物质需求。在完整的Tp中仅有Tp0326的桶形结构区域包含暴露的抗原表位。Brinkman等[8]研究发现，Tp0326具有血清反应性。然而，McGill等[20]的研究结果显示，Tp0326与早期潜伏梅毒血清无反应性，也无免疫原性。这个现象可以解释为，多肽转运相关结构域和C端β-桶形结构位点的抗原变异，从而引起Tp蛋白组中Tp0326极低水平的表达。基于这些研究成果，许多以Tp0326、Tp0453和Tp0326-Tp0453嵌合抗原为基础的检测方法和试剂盒不断被研发，进而推进其临床应用。

5.2 Tp0453 Tp0453基因全长 864 bp，编码 287个氨基酸 ，相对分子质量为 31 kDa。Tp0453是一种新型的整合外膜蛋白，定位于Tp外膜的内表面，这种蛋白质拥有大量的折叠结构和两性螺旋, 当人工加入双层膜时，此蛋白进入膜中，膜的渗透性增强，表明其可能是一种孔蛋白[27]。Hazlett等[27]研究发现, Tp0453可能使Tp的外膜对营养物质具有通透性，而抗体则无法进入。Luthra等[28]研究发现，Tp0453包括5个稳定折叠两性螺旋，这对于Tp0453与膜结合是至关重要的。基于结构动力学和结核分枝杆菌脂蛋白的比较数据，Tp0453被认为是外膜生物转化过程中脂质和糖脂的载体。从而可推测，Tp0453 在Tp摄取营养物质、维持生命的过程中起了一定的作用。在McGill等[20]的研究中，Tp0453表现出中等强度的血清反应性，可与早期梅毒患者的血清反应。Van Voorhis等[15]研究发现，基于Tp0453蛋白建立的ELISA对梅毒患者血清有较好的血清反应性，其特异性和敏感性高，而且对复发性发热、莱姆病或钩端螺旋体病患者血清均呈阴性反应。莫小辉等[29]成功制备抗Tp0453重组蛋白的单克隆抗体，经间接免疫荧光分析，表明抗Tp0453抗体能识别Tp的天然蛋白结构，且与钩端螺旋体无交叉反应。近年来，以Tp0453重组产物和嵌合的Tp0453-tp0326蛋白为诊断抗原的ELISA检测方法不断发展，Tp0453和Tp0453-tp0326嵌合体的敏感性可达98%、98%，特异性可达100%、99%[30]，因此，Tp0453有望作为Tp特异性血清学诊断的新候选抗原用于TP的大规模血清筛选。

重组蛋白技术为梅毒血清学诊断提供大量的高纯度的重组蛋白，推动了血清学检测的快速发展。但是，梅毒血清学筛查依然有许多问题亟待解决，如缩短梅毒检测的窗口期，避免晚期梅毒患者由于免疫应答水平降低而出现的假阴性结果。因此，我们有必要寻找新型的Tp重组抗原应用于梅毒血清学诊断。以重组蛋白技术为基础建立的Tp特异性血清学实验显著提高了梅毒的诊断水平，血清学试验的敏感性和特异性均达到95%以上。但这些Tp抗原实验无法区分既往感染与现症感染，也不能用于疗效判定、有无复发及再感染。目前，我们只能通过非Tp特异性血清学实验，检测反应素的滴度变化，来判定疾病的进程变化。然而，反应素并非Tp感染后特有，其在病毒性肝炎、类风湿关节炎及系统性红斑狼疮患者和老年人血清中皆可出现，从而引起假阳性结果。因此，拓展Tp重组抗原组合，提高各期梅毒的检测的灵敏度和特异性，仍是多个学科包括分子生物学、微生物学和免疫学研究的共同目标。近年来，感染依赖性抗原筛选技术的兴起，促进了病原体的诊断相关应用研究。虽然，目前关于Tp感染依赖性抗原的研究大多停留在实验室阶段，但对其深入研究可以为梅毒早期诊断及治疗提供新的靶标，且为研发梅毒新型疫苗提供新的理论基础和研究方向。