食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞检测技术临床应用专家共识(2019)

山东省研究型医院协会胸外科分会 山东省疼痛研究会加速康复外科专业委员会

在过去的20年里，食管癌已经成为恶性肿瘤疾病里发病率第8位、死亡率第6位的疾病[1,2]，总生存率仍然相当有限[3]。在接受根治性手术治疗的食管癌患者中，2/3的患者术后会出现复发及远处转移[4]。在亚洲地区，食管鳞状细胞癌(ESCC)占食管癌总数的90%以上[5]，并且5年总生存率只有15%～20%[6]。因此，有效监测疾病进展、判断预后及提高生存率，是ESCC研究领域亟待解决的问题。

循环肿瘤细胞(CTCs)是由澳大利亚病理学家Thomas Ashworth最早报道的。CTCs被发现来源于原发肿瘤细胞的克隆[7]，外周血CTCs检测被证明可作为一种预后因素，并且可能为癌症治疗提供新的策略[8]。已有研究报道，转移性乳腺癌患者中，如果用CellSearch 系统检测到大量CTCs存在，预示着患者的不良预后[9～11]。也有研究表明，CTCs在肿瘤的形成、发展和转移过程中发挥重要作用[12]。

1 CTCs定义

CTCs是从原发或继发肿瘤脱离进入血液循环的肿瘤细胞，大多数CTCs被机体免疫系统消灭或凋亡，部分CTCs经历上皮-间质转化(EMT)过程从而获得高侵袭性，极少CTCs可以形成转移性病灶[13]。此外有研究表明，循环系统中还存在循环肿瘤微栓(CTM)以及大小和形状与白细胞相似的小CTCs，但其来源均不明确[14～16]。

CTCs在血中含量非常稀少，每毫升血液中CTCs只有1～100个，增加血液样本量是提高检测准确性的可能的解决方案，但又受到时间的限制及患者护理方面的挑战。CTCs的异质性也是检测中的一个主要障碍，因为不同亚群的CTCs在生物标志物表达方面有着显著的多样性[17]。同时，单细胞分析发现CTCs蛋白质表达还存在时间和空间异质性，表明除了CTCs计数以外，这些异质性信息可能包含目前尚不清楚的生物学信息[18]。

2 CTCs检测方法

迄今为止，已有不少研究报道了CTCs的直接及间接的检测方法，这些方法在特异性、敏感性及成本方面都有着较大差异[19～26]。CTCs检测通常包含两个步骤，首先是从血液样本中进行分离富集，然后是对富集的可疑细胞进行生物标志物的确认。

CTCs的分离富集分为两种，一种是基于物理特性的分离富集技术，其特点是既不破坏CTCs形态，也不依赖CTCs表面抗原，可对单个CTCs进行进一步的形态学、免疫细胞学及遗传学特征的研究。包括CTC-Biopsy系统、Clearcell FX系统、Parsortix系统、OncoQuick系统和DEPArray系统等[20,27～31]。另一种是基于免疫学特性的分离富集技术，包括阳性富集(是依据免疫学原理，运用磁珠、黏附对CTCs进行捕获)和阴性富集(是指去除白细胞后富集CTCs)。阳性富集方法的代表是CellSearch系统，其也是惟一在欧美及中国均获批准应用的CTCs检测系统[32]。此外，采用阳性富集技术的CTCs检测系统还有LiquidBiopsy®系统、CTC-Chip系统和AdnaTest系统等[33,34]。阴性富集技术主要有Cyttel系统，其原理是利用特制的CD45免疫磁珠吸附并去除血液中的白细胞[35]。

CTCs鉴定是指分离富集后的可疑CTCs必须通过可靠的鉴定才能确定为CTCs，但该步骤处于持续探索阶段，且不同类型的恶性肿瘤CTCs会有更为特异的鉴定方法。

总之，目前ESCC患者CTCs的检测方法种类较多，但标准尚不统一，尤其在结果验证和判读等方面。

3 CTCs的检测流程及结果评判

CellSearchTM系统由于无法实现活细胞捕获并进行后续基因检测以及用药指导，目前已停产停售。有研究证实，武汉友芝友公司CTC-Biopsy®系统具有较高的敏感性及可靠性，其原理是通过高分子材料微孔滤膜过滤装置分离富集CTCs[20]，且在ESCC的CTCs检测中有着较好的应用价值[32,36]，其具体检测流程简介如下。

3.1 操作过程 每次检测需要全血5 mL，注意不要将第1管血样送检，以防止血管内皮细胞的干扰。采血后为防止凝血，应立即轻柔颠倒混匀8次。血样最好在2 h内检测，否则应静置于4 ℃环境保存(时间不能超24 h)。处理样本时需室温静置复温20 min。远距离运输血样时，应将储血装置竖直向上置于4～8 ℃采血箱中，同时避免与冰袋直接接触及剧烈晃动。使用友芝友公司的CTCs快速染色液行改良瑞氏—吉姆萨染色。

3.2 评判参数 ①细胞直径(长端)>15 μm；②核质比>0.8；③细胞核呈现异型性，如出现不规则的结节状、分叶状等；④细胞核深染且着色不均；⑤由于核膜增厚出现凹陷或皱褶，致使核膜呈锯齿或不规则状；⑥细胞核染色质边移，或巨大核仁，或异常核分裂。

3.3 评判标准 符合以上6个评判参数中的4个或4个以上判定为CTC；满足评判参数⑥之外的任意3个或单独满足评判参数⑥判定为疑似CTC；3个及3个以上的细胞成团且能鉴定为CTC，但因相互连接重叠无法准确判定为CTC的细胞团，判定为CTM；3个及3个以上的细胞成团但不足以判定为CTC的细胞团，判定为疑似CTM；不能判定为血液来源的细胞但同时也不符合上述四种类型的其他细胞判定为非血液细胞[37]。

3.4 降低CTCs检测假阳性率的建议 为降低CTCs检测的假阳性率，建议用CD45抗体ICC检测，以排除形态学特征类似CTCs的白细胞。细胞核染色为蓝色(苏木素)且细胞膜染色为棕黄色(DAB)判定为CD45阳性；细胞核染色为蓝色(苏木素)且细胞膜周围无棕黄色判定为CD45阴性。

3.5 提高CTCs检测特异性的建议 对于ESCC患者的CTCs或CTM的鉴定，在条件允许的单位可采用较为特异的鉴定方法，对捕获的细胞行P40及CD45免疫荧光检测，有着较为可靠的鉴定结果[36]。

3.6 检测时间节点及其注意事项 目前接受手术治疗的ESCC患者CTCs检测的时间点没有统一标准，根据NCCN指南中所提到的随访时间，建议在术后随访的同时，进行CTCs的检测。术后前2年每3～6月复查1次；术后第3～5年每6个月复查1次；5年后，根据情况决定是否需要继续行CTCs检测。对于治疗前患者，推荐在化疗或手术前进行检测，但要避免在手术当天进行检测。此外，结合临床实际，建议在清晨或上午6:00～9:00进行检测，抽血前可以适当饮水，避免在体液出现大量丢失的情况下检测。

4 CTCs检测在ESCC中应用的临床意义

4.1 早期筛查 健康人几乎检测不到CTCs，分期较早的ESCC患者中，CTCs的检测阳性率也极低[32,36]。所以，目前暂不推荐将CTCs检测作为ESCC患者的早期筛查。

4.2 判断预后及疗效 无论是使用CellSearch系统还是CTC-Biopsy®系统，对于ESCC患者而言，外周循环中检测到CTCs(或CTM)均提示预后不良[38,39]。

有研究发现，采用CellSearch系统对接受化疗或化放疗的90例ESCC患者进行检测，CTCs检测阳性率为27.8%，其中12例患者检测到1个CTC，4例检测到2个CTCs，5例检测到3～9个CTCs，2例检测到10～99个CTCs，还有2例患者检测到≥100个CTCs；Ⅱ～Ⅲb期患者的检测阳性率为26.9%，Ⅲc期患者的检测阳性率为11.1%，Ⅳ期患者的检测阳性率为50.0%，差异具有统计学意义(P=0.002)；CTCs检测阳性率与远处转移是密切相关的(P=0.002);并且，CTCs检测阳性率在胸膜转移的患者中是100%，在血行转移的患者中是50%，在远处淋巴结转移的患者中是40%，表明CTCs的状态与胸膜转移及血行转移是密切相关的(P<0.000 1，P=0.015)；另外，接受化疗的患者其CTCs阳性率要高于接受放化疗的患者(P=0.004)，因为研究病例数及实验设计的原因，还无法据此就得出放化疗优于化疗的结论。此外，该研究还发现CTCs检测阳性患者的总生存率显著低于CTCs检测阴性患者，前者的中位生存期只有261 d，而后者的中位生存期可达到557 d(P=0.002)；在多因素回归分析中，术前CTCs检测结果被证明是独立的预后因素(P=0.021)；在整个治疗过程中，CTCs持续阳性的患者其中位生存期为128 d，治疗后CTCs由阳转阴的患者中位生存期为514 d，治疗前检测阴性的患者中位生存期为557 d，表明在治疗及随访过程中，如果CTCs检测由阳转阴，患者则可有相对较好的预后[38]。该文献提示，CTCs检测对于ESCC患者的预后及对于化疗或放化疗疗效的判断有着较为可靠的作用。

采用基于按上皮肿瘤细胞大小分离(ISET)[20]原理的CTC-Biopsy®系统对接受手术的ESCC患者进行检测，山东大学第二医院研究团队[36]发现，Ⅲ、Ⅳ期的ESCC患者的CTCs阳性率显著高于Ⅰ、Ⅱ期患者(P=0.017)；术前外周血CTCs检测与阳性淋巴结对数比(LODDS)密切相关；在Cox风险比例回归分析中，术前CTCs检测阳性被筛选出可能会对术后生存有显著影响，如果术前及术后7 d的CTCs检测结果均为阳性，其生存曲线与其他CTCs状态的生存曲线显著分离，提示着预后不良的明显趋势，但因随访时间有限，暂未得出总生存率结果。山东省肿瘤防治研究院团队[39]发现，CTCs检测阴性的患者有着更佳的无进展生存期(PFS)，多因素分析发现，CTCs检测结果为2个以上是ESCC患者肿瘤复发的强有力、独立的预测因子；对接受手术患者的亚组进行分析，接受R0切除的术后接受辅助治疗的患者中，CTCs检测结果仍然是强有力的、独立的预测因子；对于Ⅲ期或T3+T4的患者来说，CTCs阳性患者的PFS较阴性患者显著降低。因此，对于ESCC患者，CTCs即可作为术前患者判断预后的因素，也可作为化疗或化放疗后判断疗效的指标，甚至有作为分期指标之一的潜力，治疗期间应规律复查，密切随访，综合其他血液肿瘤指标、影像学检查及患者既往是否接受了足够剂量的新辅助或辅助治疗等情况，给予更为积极的处理。

此外，有研究表明上皮来源的肿瘤细胞经历EMT是其侵袭和转移的基础，因此EMT-CTCs具有更高的侵袭和转移能力，能更好地反映患者的预后和疗效。国家重点研发计划课题“循环肿瘤细胞检测技术指导Ⅲ期食管癌新辅助化疗治疗的研究”(2016YFC0106005)研究团队发现，在ESCC组织中确实存在以上皮特性减少、间质特性增加的EMT过程，联合检测波形蛋白(Vimentin)和上皮细胞钙黏蛋白(E-Cadherin)有助于判定EMT-CTCs[40]。

4.3 指导治疗方案 目前尚未检索到CTCs用于指导恶性肿瘤患者初始治疗选择的研究，包括ESCC患者在内，也没有检索到关于CTCs指导新辅助治疗的任何研究成果。有研究表明，在乳腺癌及骨肿瘤的新辅助化疗中，CTCs是重要的判断预后的因素[41,42]，但对于行新辅助治疗还是辅助治疗，还没有任何一个恶性肿瘤将CTCs检测作为考量依据。新辅助治疗用于恶性肿瘤治疗，其重要的理论优势在于：①术前即杀灭血液中的微转移灶以降低日后复发转移的风险；②术前病灶处的血运完整，化疗药物更容易到达病灶；③术前即可判断肿瘤对于化疗或放疗的敏感性。但结合中国国情及临床实际情况，Ⅱ期及ⅢA期患者和家属对新辅助治疗的接受率偏低，包括新辅助化疗及新辅助化放疗。不论是研究及证据较多的乳腺癌[43,44]还是研究相对匮乏的ESCC[38]，都被认为患者CTCs检测结果可以反映肿瘤进展的真实状态及肿瘤对于治疗的反应，所以其检测对于新辅助化疗或新辅助化放疗或术后辅助治疗的指导方面具有潜在的临床研究前景。例如：①对于术前CTCs检测即为阳性的患者，是否更适合于新辅助治疗；②对于术前CTCs检测为阴性的患者，接受新辅助治疗与术后辅助治疗相比较是否生存无显著差异；③对于术前完成新辅助化疗或术后辅助化疗的患者，其CTCs仍持续、大量存在是否意味着对该化疗方案耐药、术后需要改换化疗方案；④在复查监测的过程当中，患者的CTCs检测结果由阴转阳，但影像学及其他肿瘤学指标均为阴性，是否可作为化疗的依据，尤其是当检测到的CTCs或CTM出现上皮间质转化时(EMT-CTCs具有更高的侵袭和转移能力)。这几项临床重大问题的解决还需要设计更大样本量、更为严谨的研究来证实。

另外有关新辅助化疗与新辅助化放疗，国家重点研发计划课题“循环肿瘤细胞检测技术指导Ⅲ期食管癌新辅助化疗治疗的研究”(2016YFC0106005)研究团队所实施的ESCC患者治疗的网状Meta分析[45～47]结果表明，新辅助化疗和新辅助化放疗与单独手术相比，都可提高患者的总生存率。在拥有较大病例数的多中心、前瞻性、随机对照研究匮乏的情况下，网状Meta分析的确为不同治疗手段之间的间接比较提供了解决方案，但由于其纳入研究的异质性，如不同年代的分期系统差异，纳入患者年龄、分期等差异，化疗药物选择、剂量及化疗周期差异，放疗方法及照射剂量等差异，分析方法差异(贝叶斯法与频率学家方法)，网状Meta分析的结果需谨慎对待。目前，国内外的主流指南均推荐Ⅱ期及Ⅲ期的ESCC患者应接受新辅助化疗或新辅助化放疗，有条件的单位可结合患者的临床分期、CTCs检测结果及患方的依从性等因素综合考量并决策。

5 展望

CTCs的发现尽管已经经历了一个多世纪，但由于稀少性、瞬时性、EMT等原因导致捕获困难，其在ESCC的临床应用曾较为困难。但近年来，由于CTCs分离检测技术日趋成熟，其在临床上逐渐应用。目前的研究表明，CTCs在ESCC中与预后预测、复发转移风险的评估以及治疗效果的判断等密切相关。

不可否认，CTCs在临床应用中仍存在很多困惑甚至是困难，如CTCs检测结果是否可以用于ESCC的分期，是否可用于指导临床决策(如是否选择新辅助治疗或随访过程中是否需要化疗等)，这些还需要设计更大样本量、更为严谨的研究来探索与证实。

讨论专家：

田辉(山东大学齐鲁医院)，张百江(山东省肿瘤医院)，王伟(山东省胸科医院)，丛波(山东大学第二医院)，宋晓明(山东省千佛山医院)，王磊(山东省立医院)，张林(山东省立医院)，张永明(山东省肿瘤医院)，范兴龙(山东大学齐鲁医院青岛院区)，岳韦名(山东大学齐鲁医院)，张康(济宁市第一人民医院)，赵小刚(山东大学第二医院)，彭传亮(山东大学第二医院)

秘书组：

赵云鹏(山东大学第二医院)，单磊(山东大学第二医院)，王永强(山东大学第二医院)，张文豪(山东大学第二医院)