阿月浑子杂种幼胚培养中褐化影响的研究

庞 曼 ，张 心 ，路 斌 ，冯献宾 ，路丙社 ，王 超

（1.定州市绿谷农业科技发展有限公司，河北 定州 073006；2.定州市科技技术局，河北 定州073006；3.河北农业大学 园林与旅游学院，河北 保定 071000）

阿月浑子（Pistacia vera L.）为漆树科黄连木属落叶小乔木，是世界著名干果和木本油料树种，俗称“开心果”，具有很高的经济价值，我国阿月浑子虽然已有上百年的栽培历史，但根腐病、黄萎病和叶斑病危害严重，黄连木是我国特有的乡土阿月浑子砧木资源和育种材料，对阿月浑子叶斑病有很强的抗性。通过杂交育种将阿月浑子早实丰产优良特性与黄连木高抗病优良性状整合在一起，培育适宜中国气候特点的抗病高产阿月浑子新品种前景广阔[1-4]，但杂种胚败育严重，幼胚培养是解决杂交胚败育的有效途径。因此，建立杂种胚抢救体系对实现阿月浑子的杂交育种有十分重要的科学意义和应用前景。在植物组织培养中，外植体的褐化经常发生，而褐化直接影响外植体的脱分化和再分化，甚至决定组培能否成功[5]。在建立阿月浑子幼胚离体培养体系时，褐化是导致培养材料死亡的主要原因之一。本试验对阿月浑子幼胚培养褐化的原因及克服措施进行了研究。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为河北省邯郸市阿月浑子栽培示范园内阿月浑子杂交果实，杂交父本为黄连木，杂交母本为引自美国的阿月浑子“Kerman”。

1.2 试验方法

采集授粉后的杂种果实，于冰箱5 ℃冷藏后，去掉外果皮在流水下冲洗30 min，在超净工作台上用75%酒精浸泡2 min，20%次氯酸钠灭菌10 min，无菌水冲洗3～4次，置于无菌滤纸上使种子表面的水分吸去，用已消毒的解剖刀和镊子除去种皮或留存种皮，然后接种培养。每处理接种15瓶，重复3次，20 d后统计褐化率。

1.3 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 果实发育期对褐化的影响

由表1可以看出，80～120 d的果实褐化率和成活率存在显著差异，但杂交果实的种胚随着胚龄的增加，褐化率和成活率也显著增加；授粉后80 d，100 d和120 d的杂种褐化率分别为30.66%，65.09%和75.63%，成活率分别为40.33%，61.67%和85.39%；从授粉后80 d至100 d褐化率增加了34.43%，成活率增加了21.34%。对果实解剖观察发现，授粉后80 d时种胚刚刚开始发育，但胚体很小，授粉后100 d时种胚已明显发育，约占果腔的1/2；授粉后120 d时果实正常发育的种胚已充满果腔，其果实发育越成熟，成活率越高，褐化程度也越高。

表1 胚龄对褐化的影响

2.2 种皮对褐化的影响

由表2可以看出，种皮的存在与否对于阿月浑子杂种胚的褐化率和成活率影响显著。未去种皮处理接种的杂种胚褐化率和成活率分别为84.08%和15.84%，并且胚的子叶开始变褐或变黑，基本没有再生小苗的可能性，而去种皮处理下，幼胚在接种20 d后褐化率和成活率为56.23%和92.49%，胚的萌发及生长良好，子叶开张，变绿，并且可获得杂种小苗。种皮存在使褐化程度增加，抑制胚的萌发及成活，因此在进行杂种胚的胚培养或抢救时，去掉种皮培养有利于降低杂种胚的褐化，提高成活率。

表2 种皮对褐化的影响

2.3 不同培养温度对褐化的影响

由表3可以看出，不同的培养温度对杂交幼胚褐化的影响很大，随着温度的增加，幼胚的褐化率呈现逐渐上升的趋势。在18 ℃温度条件下，幼胚褐化率最低，即35.33%；而在26 ℃温度条件下，幼胚褐化率为55.00%，虽然温度只增加了8 ℃，褐化率却增加了19.67%。说明低温对褐化有一定抑制效果。

表3 培养温度对褐化的影响

2.4 光照对杂种胚生长的影响

由表4可以看出，培养过程中光照的存在与否对于阿月浑子杂种胚的褐化有显著影响，阿月浑子杂种胚在光照条件下褐化率为58.57%，而在黑暗条件下为36.23%。在黑暗条件下培养，胚培苗褐化较轻，生长的速度明显加快，叶片较小且发黄。分析认为光照能够促进阿月浑子组织培养中酚类物质的氧化，加速组织褐变速度。因此，黑暗可以减轻褐化，有利于促进胚体所含营养物质的转化和运输，从而有利于幼苗健壮生长。

表4 光照对褐化的影响

3 结论与讨论

褐化是离体组织细胞中多酚氧化酶活性增加，致使酚类物质氧化生成棕褐色醌类物质的结果[6-7]。阿月浑子远缘杂种胚培养中褐化程度严重与否对成苗有着直接的影响。影响褐化的因素有很多方面，如合子胚的发育程度、杂交幼果的取样时期、低温冷藏处理时间、基本培养基的选择以及激素的添加使用情况等。本研究以阿月浑子杂种幼胚为材料，着重研究探讨了胚龄、种皮去留、培养温度和有无光照培养条件对褐化的影响。

3.1 胚龄的影响

由于植物种类、发育时间不同，幼胚离体培养的成功率也不同。胚的发育程度即胚龄，是幼胚萌发成苗及培育健壮幼苗的前提和关键。一般胚的发育程度与褐化、成活率呈正相关，胚的发育程度越低，即胚的发育阶段越早，褐化率和成活率越低；随着胚的发育程度越高，成活率越高。因此，准确把握幼胚获取时间至关重要[7]，阿月浑子杂种胚培养适宜的胚龄为授粉后100 d。

3.2 种皮去留的影响

本试验中阿月浑子杂种幼胚种皮去留的试验结果表明，去种皮接种褐化率明显好于未去种皮的处理，可见种皮是抑制褐化的主要因素之一。因此，阿月浑子杂种胚培养时应采取去种皮方式接种培养。

3.3 温度和光照的影响

一定程度的高温和光照强度能激活PPO活性，促进酚类物质的氧化，加速组织培养的褐化[5，8]。本试验对阿月浑子授粉后120 d幼胚进行了不同温度和光照强度的培养，结果发现在18 ℃低温条件下和暗培养情况下可明显减轻褐化的发生。