石蒜碱衍生物LY-09对两种癌细胞增殖和迁移的影响

徐潇奕 刘晶莹 刘 浩

1 天津市人民医院口腔科 天津 300191；2天津市口腔医院口腔科

恶性肿瘤严重威胁人类的生命健康，进入21世纪，恶性肿瘤仍然是极大威胁人类生命健康的疾病[1]。目前国际上常用的抗肿瘤药物有近百种，但大多数药物仅缓解病情。此外，随着化学药物在肿瘤临床治疗的广泛应用，突出的耐药性问题极大地限制了药物疗效的发挥[2]。因此，寻找新型的化疗药物，是抗肿瘤药物领域亟待解决的问题。

石蒜碱(Lycorine)是从石蒜鳞茎中分离得到的一种异喹啉类生物碱，具有广泛的抗疟疾、抗炎、抗病毒、镇痛以及抗肿瘤等药理学作用[3]。迄今为止，石蒜碱及其衍生物被报道对淋巴瘤、黑色素瘤、白血病、食道癌、非小细胞肺癌等起到了不同程度的抑制作用[4]。石蒜碱通过停滞细胞周期以及诱导细胞凋亡达到对白血病肿瘤细胞的抑制作用，显著降低HL60、K562、ARH77 等多种血液肿瘤细胞的存活率[5]。进一步对细胞凋亡分子机制的研究表明，在石蒜碱诱导肿瘤细胞凋亡的通路中，Bcl-2蛋白家族和半胱天冬酶起着关键的调节作用[6-7]。同时，在石蒜碱诱导凋亡的细胞中发现了p21和THF-a的上调现象[8-9]。针对石蒜碱的结构改造与修饰，发现了一系列具有显著抗肿瘤活性的衍生物，其中LY-09对人肺癌细胞NCI-H460具有较好的抑制能力。本实验主要研究石蒜碱的衍生物LY-09对人乳腺癌MCF-7细胞和人肺癌细胞A549增殖、凋亡的影响，并且探讨了上市抗肿瘤药SAHA[10]、阿霉素[11]与LY-09的联合使用的抗肿瘤药效情况。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 A549细胞株和MCF-7细胞株购于中国医学科学院肿瘤细胞库。LY-09，受赠于南开大学药学院；SAHA和阿霉素盐酸盐(DOX)，购于Sigma公司，均采用95% DMSO (sigma) +5%PBS或无菌ddH2O配制成20 mM的母液，-20 ℃保存备用，实验前使用细胞所需的完全培养基稀释成所需浓度。

1.2 A549和MCF-7细胞培养 A549细胞株和MCF-7细胞株采用RPMI1640培养基培养，培养基中添加10%胎牛血清Hyclone，1%青霉素-链霉素，于5 % CO2、37oC细胞培养箱中培养，2～3 d采用0.25%的胰蛋白酶进行消化处理，传代一次，取对数生长期的稳定生长细胞用于实验。

1.3 MTT法检测LY-09对肿瘤细胞增殖的影响 以5 000个/孔的细胞量，将A549和MCF-7细胞分别接种于96孔板中。置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后，将梯度稀释的测试化合物LY-09以及阳性对照阿霉素和SAHA分别加入96孔板中，每个浓度有三个复孔，测试浓度梯度为3，1，0.3，0.1，0.03，0.01，0.003 μM。于37℃ 5%CO2培养箱中培养72 h后，每孔加入20 μL MTT (5 mg/mL)，培养。培养箱中孵育4 h，弃除残余培养液后，每孔加入150 μL DMSO，酶标仪测OD570值。数据采用origin7.5处理，拟合出EC50值。

1.4 LY-09分别与阿霉素、SAHA联合用药 将A549细胞和MCF-7细胞分别置于96孔板，每孔加入2 000个细胞，每孔100 μL，第一行加空白培养基作为对照，其他孔全用于铺细胞，置37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后，将梯度稀释的化合物加入96孔板中，每个浓度有三个复孔。置于37℃、5%CO2培养箱中培养72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培养4 h，弃除残余培养液后，每孔加入150 μL DMSO，酶标仪测OD570值。利用MacSynergy得到LY-09与其他药物联合用药时的联合作用效果三维图。

1.5 LY-09体外抗肿瘤细胞迁移实验 A549和MCF-7细胞以25 000～50 000个/孔的细胞量，将细胞接种于96孔板中。置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，随后采用200 μL移液器的枪头对细胞进行划痕，并用PBS清洗3次，200 μL/次，将漂浮的细胞洗去。将之前配制的20 mM的LY-09，母液用完全培养基进行逐级稀释使其浓度为0.05，0.02，0.008，0.0032和0.00128 μM，加入不同浓度的LY-09，阿霉素作为阳性对照药，每孔200 μL，且每个浓度设置三个复孔。置于37°C、5%的CO2培养箱中继续培养，分别于0、24、48、72、96 h采集细胞照片。

1.6 统计学方法 本研究采用SPSS 17.0进行数据处理与统计学分析。多组进行比较使用单因素方差分析研究，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LY-09对A549和MCF-7增殖的影响 A549和MCF-7细胞经受试药LY-09及阳性对照药处理后，MTT检测发现LY-09可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，且效果与剂量、时间呈现相关性，差异具有统计学意义(P< 0.05)，见表1。与阳性对照药阿霉素比较，LY-09的活性与其相当，二者的EC50值在同一数量级，且显示了优于阳性对照药SAHA的生物活性，见表2。对于A549和MCF-7细胞株，LY-09对于肺癌细胞A549的抑制活性优于乳腺癌细胞MCF-7，表明LY-09可能具有一定的细胞特异性。

表1 不同剂量LY-09对A549和MCF-7增殖抑制率的影响

注：*P< 0.05。

表2 LY-09及阳性对照阿霉素、SAHA在各肿瘤细胞中的EC50值

注：*P<0.05。

2.2 LY-09与阿霉素、SAHA的联合用药研究 为了进一步考察LY-09的肿瘤抑制活性，本研究将LY-09分别与阿霉素、SAHA联合使用，探索其是否具有协调作用。通过联合用药三维示意图我们得知，LY-09与阿霉素联合用药时，在A549和MCF-7存在一定的拮抗作用，见图1a和b。然而LY-09与SAHA联合用药时，在A549和MCF-7细胞株上存在一定的协同作用。这个结果可以为未来的抗肿瘤领域联合用药提供一定的参考依据。

a LY-09与阿霉素联合用药，作用于A549的结果；b LY-09与阿霉素联合用药，作用于MCF-7的结果；c LY-09与SAHA联合用药，作用于A549的结果；d LY-09与SAHA联合用药，作用于MCF-7的结果。

a LY-09抑制A549迁移的结果；b LY-09抑制MCF-7细胞迁移的结果；c阿霉素抑制A549迁移的结果；d 阿霉素抑制MCF-7细胞迁移的结果。

2.3 LY-09抑制肿瘤细胞迁移的结果 本研究采用了A549和MCF-7细胞，分别考察了LY-09和阿霉素抑制细胞迁移的能力。细胞划痕实验结果显示，96 h后空白对照组中的细胞向划痕边缘迁移的速度快，细胞铺展迅速，划痕的宽度随着时间的延长明显变窄，说明细胞已经迁移到划痕的中央。在低浓度下的LY-09，0.001～0.008 μM，对于A549和MCF-7细胞的迁移抑制较差，而在较高浓度0.02、0.05 μM下，LY-09可以明显地抑制A549和MCF-7细胞的迁移，细胞向划痕边缘迁移的速度明显减慢。72 h检测时，LY-09组划痕的间距基本没发生变化，与空白对照组相比，差异具有统计学意义。在阳性对照药阿霉素组，加药浓度0.128、0.256、0.62 μM，与空白对照组相比，阿霉素可以减缓肿瘤细胞的迁移，但是72 、96 h与空白对照组差异没有统计学意义，说明阿霉素抑制细胞迁移能力不及LY-09。

3 讨论

恶性肿瘤的发病率不断上升，严重威胁着人类的生命健康。化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段，尽管化疗药物种类不断增加，其中细胞毒性作用药物临床应用十分广泛，但是伴随了严重的不良反应。因此，找寻具有良好的抗肿瘤药效且低毒性的抗癌药物具有重要意义。

石蒜碱是石蒜科植物中提取出来的一种生物碱，理化稳定性高，它对多种肿瘤细胞均有良好的抑制作用[12-13]。LY-09是石蒜碱2位衍生化得到的衍生物，本研究发现其对不同肿瘤细胞均显示了良好的抑制活性。MTT实验结果表明，与空白对照组相比，LY-09对A549和MCF-7细胞的增殖抑制能力显著增加，与阳性对照药阿霉素和SAHA相比较，LY-09抑制肿瘤细胞增值的活性优于SAHA, 而与阿霉素的活性相当。细胞划痕实验结果表明，随着LY-09加药浓度的增加，A549和MCF-7细胞迁移抑制作用明显增强，而且其效果远远优于阳性对照药阿霉素。有研究表明，石蒜碱可以抑制信号传导及转录激活因子的信号转导，促进肿瘤细胞上皮改变，逆转肿瘤细胞间质特征，促使波形蛋白、纤连蛋白等表达减少，从而阻断细胞迁移和侵袭的途径[14]。以上结果说明，石蒜碱衍生物LY-09具有抑制肿瘤细胞增殖和迁移的生物学活性。

基于联合用药广泛应用于恶性肿瘤的治疗，具有不同作用机制和作用方式的多种药物同时使用可针对单个靶点或疾病增强作用效果。本研究初步探索了石蒜碱衍生物LY-09的作用机制，将其与上市抗肿瘤药物阿霉素、SAHA的联合用药，发现LY-09与阿霉素之间存在拮抗作用，而与SAHA联合使用可以发挥协同作用。阿霉素是一类典型的抑制DNA和RNA合成的抗肿瘤药物，SAHA则是一类抑制组蛋白去乙酰化酶功能的抗肿瘤药。本研究的结果表明，LY-09的作用机制可能与细胞DNA的合成可能不存在较强的相关性，而是与组蛋白去乙酰化酶相关细胞通路有关。Wang等[15]发现石蒜碱通过线粒体途径诱导caspases激活前蛋白进而促进人白血病细胞凋亡，而组蛋白去乙酰化酶的功能调节与caspase信号通路密切相关，这也解释了石蒜碱衍生物LY-09与SAHA联合用药具有协同的抗肿瘤活性。

综上所述，石蒜碱衍生物LY-09对人肺癌细胞A549和乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有显著的抑制作用，与阳性对照药阿霉素相比，LY-09抑制肿瘤细胞迁移的效果更加显著。LY-09与上市药物SAHA的联合用药，可以发挥协同效应，这为石蒜碱衍生物在抗肿瘤方面的应用提供临床前理论依据。