综述牛奶中黄曲霉毒素M1的检测方法

张 佳 左英芳 王 丹 关婷婷 秦 娜

（焦作市畜产品质量安全监测中心，河南焦作 454003）

1 理化性质

黄曲霉毒素 M1（Aflatoxin M1，AFM1），分子式为 C17H12O7，熔点（裂解温度）299℃，是黄曲霉毒素中一种二氢呋喃杂萘邻酮衍生物。研究表明，AFM1是黄曲霉毒素B1（AFB1）的羟基化衍生物，即由AFB1转化而成。它常温下呈片状结晶，溶于乙腈、甲醇、氯仿、丙酮等极性有机溶剂，非极性溶剂（乙醚、正己烷、石油醚等）不溶解。AFM 1 的化学结构稳定，耐热耐酸。AFM 1 毒性和致癌性均强，是已知的20种黄曲霉毒素中毒性最强的，仅次于AFB1，相当于5倍的氰化钾，40倍的砒霜。经机体吸收后，作用于肝脏，易引起肝肿瘤和肝癌。

2 牛奶中AFM1限量标准

AFM1是牛奶质量安全风险评估的主要危害因子，各国分别制定牛奶中AFM1限量。其中欧盟各国对婴幼儿配方牛奶限量为0.025 μg/kg，我国规定婴儿乳品限量值为不得检出，牛乳中AFM1限值为0.5 μg/kg[1]。

3 检测方法

目前牛奶中AFM1检测方法主要有薄层色谱分析法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱法（LC-MS）和快速检测法。

3.1 TLC法

TLC法为定性半定量法。利用黄曲霉毒素M1在365nm波长下发出蓝紫色荧光的特性，提取、浓缩、分离样品，在薄层板上显示荧光，对照标准品的荧光强度，定量含量。此法为AFM1的经典方法，设备简单，适用于大规模的筛查研究，缺点为半定量方法，试验步骤多，干扰因素多且因接触AFM1有安全危害。

3.2 HPLC法

利用免疫亲和柱或C18柱反复进行萃取和洗脱，分离试样中的AFM1，结合荧光检测器定量含量。方法为：100ml试样加热至40℃，加入1.0gNaCl，5000r/min离心15min，50ml清澈液缓慢过免疫亲和柱或C18柱，10ml水、4ml乙腈洗脱备用。色谱条件为：Thermo Scientific Hypersil BDS C18 柱，25%乙腈水作流动相，365 nm激发波长、435 nm发射波长，20 μl进样量，外标法定量。胡宏灿等用此方法测得回收率为 68～85%，分离能力强、特异性好、结果可靠准确。但所需仪器昂贵，前处理麻烦，需用免疫亲和柱，检测成本高。

3.3 LC-MS法

LC-MS法是利用质荷比的分析方法，试样各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，再其在电场和磁场中运动轨迹的不同，分别聚焦而得到质谱图，进而定性定量。此法作为广泛使用的定量方法，具有准确度高、灵敏度更高、选择性更强的特点，但与HPLC法相比均所用设备昂贵，成本高。两种方法都需用到免疫亲和柱，由于牛奶中含有大分子蛋白质，即使超高速离心也难以得到澄清液体，导致过柱速度过于缓慢，大大降低实验效率。左英芳等在GB5009.24-2016基础上，将免疫亲和柱改为Bond Elut Plexa 固相萃取柱，用乙腈提取，3ml液体过柱，增加正己烷和20%丙酮-二氯甲烷净化，结果表明节约时间成本、增加实验效率、减少检测成本，满足实验灵敏度要求，但存在固相萃取柱选择性较低、响应度较低的问题。姜学涯等结合牛奶特性，乙腈提取，加入乙酸锌及亚铁氰化钾溶液，震荡离心取上清液过滤膜备用。采用Inersil ODS-3色谱柱，以0.1%甲酸和甲酸铵溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱，流速：0.25 ml/min，正离子模式监测，MRM模式定量分析。该法解决了常规方法前处理程序繁琐、样品难过柱的问题，结果表明前处理成本仅为国标法比的1/8，检测效率提高了2倍，且能准确定性定量。

3.4 酶联免疫吸附快速检测法

此法为定性方法，结合抗原抗体的免疫反应、酶的高效催化作用，生成有色物质，肉眼观看颜色深浅判断含量，适用于风险监测等大规模样本监测的普选和初筛，具有结果准确，操作步骤简单、成本较低的优点，因此在食品检测、分析化学等领域广泛应用。李江等用60%甲醇水提取试样，采用1∶4纯水稀释，酶联免疫法测定AFM1。结果表明AFM1的回收率在90%～110%之间，符合方法要求（50%～120%），且快速、稳定。胡宏灿等研究比较了酶联免疫吸附快速检测法和HPLC法，发现快速检测法快速、经济、灵敏度高，但重复性差，偶尔存在假阳性和假阴性等缺点，从而提出处理批量样品时，结合快速法和HPLC法，先初步筛选出阳性样品，再利用HPLC法准确定性定量，可大大提高效率。李松励等采用酶联免疫吸附测定的方法对河北省、河南省、黑龙江省、山东省和内蒙古自治区5个主产区的5 080份生鲜乳进行测定，系统分析我国当前AFM1的污染现状，得出污染发生率为 4.6%，我国AFM1的污染情况正在改善，冬季污染发生率为11.2%，远远高出春秋夏季，故冬季需提前做好饲料防霉脱毒等污染防控措施。