CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用

王韶嵘综述 高兴春 陈芳妮 乔文伟 米亚静审校

作者单位：710021西安医学院公共卫生学院(王韶嵘，陈芳妮)；710021西安医学院基础医学部(高兴春，米亚静)；710021西安医学院临床医学院(乔文伟)

恶性肿瘤严重威胁着我们的健康，根据国家癌症中心发布的全国癌症统计数据显示，2014年我国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例(男性211.4万例，女性169.0万例)，2015年这一数字达到400万。恶性肿瘤是由遗传因素、环境因素及机体免疫系统等在内的多种因素共同作用下所引发的，其发病机制复杂，目前还不能完全阐明其具体机制。此外，恶性肿瘤的治疗主要依赖于放、化疗及手术治疗，但对于放、化疗均不耐受或已经处于晚期、失去手术机会的患者仍然没有一种有效且具有特异性的治疗方法，这些导致恶性肿瘤患者的治愈率不高且预后极差。CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅猛，具有广泛的应用前景，研究人员开创性地将其应用到肿瘤的研究中，探索复杂的肿瘤表型与基因功能间的关系，为肿瘤的研究及治疗提供了新的技术。

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术

1.1 CRISPR发展历程

1987年，日本科学家在研究碱性磷酸酶基因时发现该基因编码区下游存在一系列的重复片段(Repeats)，中间以非重复片段(Spacers)间隔相连。这些片段的长度在24～48 bp不等，具有二重对称性，为其形成发夹结构提供基础。2002年，Jansen等[1]首次明确定义了细菌基因组中的CRISPR/Cas9系统。在2005年研究人员又发现CRISPR中的很多间隔序列来源于质粒或噬菌体外源DNA，因此提出了CRISPR/Cas系统可能是细菌的适应性防御系统的假说[2]。2007年，Barrangou等[3]第1次通过实验验证了CRISPR间隔序列可以通过与噬菌体相应序列的匹配来发挥适应性免疫反应。随后CRISPR/Cas系统的作用机制逐渐被揭开，目前，CRISPR/Cas9技术作为一种快速高效的基因编辑技术，已被应用于人类细胞、小鼠、大鼠、斑马鱼、酵母、果蝇、现充、拟南芥、非洲爪蟾[4]等领域的研究中，发挥了不可忽视的作用。

1.2 CRISPR/Cas9系统作用机制

根据核酸内切酶的识别及切割机制的不同，CRISPR/Cas系统分成2类5型，共16个亚型[5-6]，在此主要介绍其中操作较为简洁并且应用广泛的来源于酿脓性链球菌的2类Ⅱ型CRISPR/Cas9系统。

CRISPR RNA(crRNA)、反式激活CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA)、Cas9蛋白是CRISPR/Cas9系统的3个重要组成要件。在外源DNA第1次入侵噬菌体或细菌时，CRISPR/Cas9系统会特异性的捕获一段被称为proto-spacers的外源DNA序列，整合入细菌CIRSPR序列形成位于目标位点下游的间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)。当同一外源DNA第2次进入细菌时，CRISPR/Cas9转录生成前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，在RNaseⅢ的作用下被加工成为成熟crRNA。crRNA的3' 端通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链二级结构-R环，引导Cas9蛋白聚集在其周围形成CRISPR核糖核蛋白复合体。复合体中crRNA的5' 末端特异性识别目标序列，同时识别PAM的NGG位点后，CRISPR/Cas9对外源DNA进行靶向切割，形成DNA双链缺口(doubt strand breaks,DSBs)。DNA在自我修复的过程中优先使用易出现失误的非同源末端连接(nonhomologous end-joining，NHEJ)，错误地引入碱基使DNA发生突变，就完成了基因敲除的目的。在切割过程中，PAM位点通常作为识别位点存在，而更重要的是PAM位点还是区别自身DNA与外源DNA防止发生自身免疫的识别位点。随着研究的深入，研究人员用单链导向RNA(sgRNA)代替crRNA与tracrRNA形成的R环，同样可以实现Cas9蛋白对目标基因定点切割的目的。

1.3 CRISPR与其他基因编辑技术的比较

除新型的CRISPR/Cas9技术外，基因编辑技术还有ZFN和TALEN。ZFN和TALEN作为基因编辑技术中不可或缺的方法，至今仍被广泛应用，而CRISPR/Cas9技术作为新型基因编辑技术，有其自身的优势：①可编辑位点多。理论上，在基因组中每8 bp就有1个合适CRISPR/Cas9编辑的位点[7]，分布频率高，而对于ZFN和TALEN，在基因组中平均要500 bp和125 bp才会有1个合适的编辑位点。②切割复合体简单。针对于不同的基因序列，ZFN需要设计不同的识别结构域，不仅操作复杂，还耗费时间、人力和财力；而CRISPR/Cas9技术只需要一段sgRNA即可识别目的序列发挥基因编辑作用。③可同时进行多个位点基因的编辑。研究者可以设计多条sgRNA引导序列，同时导入目的细胞即可同时编辑多个靶位点。有研究报道[8-10]，CRISPR/Cas9系统在小鼠和斑马鱼中可以同时编辑5个基因，在大鼠细胞中可以同时编辑3个基因。而ZFN和TALEN技术大多只针对1个目标靶点进行编辑，就这方面而言，CRISPR/Cas9编辑技术具有明显的优势。

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究中的应用

CRISPR/Cas9系统作为新出现的一种基因编辑技术具有操作简便、快速省时等优点，已经被研究人员广泛应用到肿瘤的研究及治疗中，并取得了令人鼓舞的结果。

2.1 建立癌症动物模型

癌症动物模型的建立是研究癌症相关基因功能的一个重要手段。在传统的动物模型建立中，研究人员的技术操作仅限于受精卵水平，利用同源重组技术对胚胎干细胞进行基因编辑。例如，研究人员通过一系列ES细胞操做或原核注射等方式对小鼠进行基因改造，筛选产生生殖系嵌合体的小鼠，进而培育出单基因敲除的小鼠。但是这种方法存在很多问题：获得敲除小鼠的时限较长、饲养小鼠的成本高昂等。此外，不能同时在小鼠或者ES细胞中引入多种修饰基因，这仍然是限制该方法在疾病研究应用中的一大阻碍[11]。而CRISPR/Cas9技术则极大地简化了癌症动物模型的建立，该技术不需要建立复杂的ES细胞系，极大程度地缩短了时限、缩减了成本。2013年，Jenisch团队证明了CRISPR/Cas9系统在单个步骤中可以在小鼠ES细胞中同时编辑5对(Tet1、Tet2、Tet3、Sry、Uty-8)基因，为获得携带目的基因的小鼠提供了便利。

此外，科学家首次利用水流动力学注射，通过小鼠尾静脉向野生型小鼠体内注射包含Cas9和gRNAs的质粒，靶向敲除肝细胞内的抑癌基因PTEN和p53，快速地获得了患有肝癌的小鼠模型，有利于肝癌机制的研究的开展[12]。同年，在成功构建肝癌模型后，张峰团队及Phillip A.Sharp团队的Sidi Chen等又成功构建了小鼠肺癌模型[13]，他们首先利用Cre-loxP系统将Cas9基因敲入小鼠体内，构建Cas9小鼠模型后，将筛选出来的3个基因：KRAS、p53、LKB1基因的sgRNA分别转导入小鼠体内，迅速获得肺腺癌小鼠模型。

人们对于脑瘤的发病机制缺乏了解，导致对脑瘤的治疗不能达到令人满意的效果。2016年，Mao等首次利用CRISPR/Cas9技术建立了小鼠脑瘤模型，改善了传统脑瘤动物模型中存在的问题，能够更精确地进行脑瘤相关靶点的研究。同时，实验中还确定了13种与脑瘤发病密切相关的一些调节因子(p53、Nf1、Pten、Ptech1、Bmi1、Met、Notch1、CDK6、miR-10b、TERT、LSD1、miR-218、miR-128)[14]。

2.2 癌症发生发展的机制研究

在肿瘤的研究进程中，运用离体细胞培养的方式来研究肿瘤的发病机制是必不可少的。CRISPR/Cas9技术使得研究者可以更方便、更快捷地获得肿瘤细胞系。在早期的研究中，研究者利用Cas9蛋白切割靶DNA，DNA双链发生断裂后有2种修复方式：非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源末端连接(homologous directed repair，HDR)，其中NHEJ修复后产生插入或缺失突变，使DNA双链发生移码突变或无义突变，从而达到敲除基因的目的。汪超甲等[15]利用CRISPR/Cas9表达载体敲除了在神经胶质瘤细胞中高表达的Pyk2，抑制了胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力，揭示了其在胶质瘤发生、发展的作用，为未来治疗胶质瘤提供了理论基础。

为了进一步提高CRISPR-Cas9系统的有效性，拓展CRISPR/Cas9系统在其他方面的应用。近几年的研究发现了一种Cas9蛋白的突变体Nuclease-dead Cas9(dCas9)，这是一种丧失了核酸酶活性的Cas9蛋白，通过与DNA序列的结合阻止转录过程，进而实现对基因表达的抑制作用。这种具有dCas9的CRISPR系统被称为CRISPR干扰(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat interference， CRISPRi)技术。该系统提供两种不同的功能，一种为dCas9介导的抑制作用CRISPRi(例如KRAB)，另一种为dCas9介导的激活CRISPRa(例如VP16和VP64)[16]。利用这2个功能研究人员不仅可以通过敲除基因探究基因功能，还可以通过dCas9激活技术筛选、鉴定原癌基因，有助于发现新的基因治疗靶点[17-19]，为未来肿瘤机制的研究提供重要的基础。

3 CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤治疗中的应用

3.1 基因修复及敲除

在肿瘤细胞形成的过程中，原癌基因的激活与抑癌基因的沉默均可以导致肿瘤的发生。恢复、提高抑癌基因的表达，就成为了一种治疗肿瘤的新思路。慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML) 的发生常与体内抑癌基因ASXL1的突变有关，并且影响患者的预后。Simona等[20]利用CRISPR/Cas9技术靶向修复了KBM5细胞中ASXL1的无效突变，显著降低了KBM5细胞的增殖速率，增强了细胞的分化，并且经过ASXL1基因修复的荷瘤小鼠的生存时间较未经ASXL1修复的荷瘤小鼠生存时间长。

此外，由于表观遗传学在肿瘤发生中的重要作用，通过表观遗传学与CRISPR/Cas9系统影响肿瘤发生发展过程中的关键基因的表达，可能成为未来很有价值的一种肿瘤治疗手段。例如，表观遗传修饰与dCas9融合或由scRNA招募到目标位点，通过改变目标位点的甲基化状态或者以特定的方式影响其对组蛋白的修饰，实现对肿瘤进行治疗的目的。

3.2 打破机体免疫耐受

肿瘤细胞在体内通过对自身的组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)进行修饰从而建立免疫耐受，逃逸免疫系统的杀伤，因此研究人员通过打破其免疫耐受实现治疗的目的。目前肿瘤细胞免疫治疗的方法包括：特异性T细胞受体修饰的T细胞治疗(TCR-T)和嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗(CAR-T)。这两种免疫治疗方法都是通过在T细胞的表面表达特异性受体，从而发生特异性识别、杀伤靶细胞的免疫应答反应，其中CAR-T技术在治疗血液肿瘤和非霍奇金淋巴瘤上有显著疗效。但这种方法会导致CAR基因随机插入到受体细胞的基因组上，可能引起遗传副作用的发生。因此，2017年Eyquem Justin等利用CRISPR/Cas9技术构建了新一代CAR-T细胞[21]。CRRISPR/Cas9系统通过编辑T细胞中的TRAC(T-cell receptor a constant)基因，将CAR基因特异性地插入到受体细胞基因组，避免了遗传副作用的发生、增强了T细胞的效力，并且延迟了效应T细胞的耗竭。这一结果也在急性淋巴细胞白血病的小鼠模型中得到了验证。

此外，研究人员还利用CRISPR/Cas9编辑技术敲除PDCD1基因实现了肿瘤免疫治疗。在人体肿瘤微环境中，程序性死亡受体(programmed cell death protein 1，PD-1)是由PDCD1基因编码的产物，在人体抗肿瘤免疫应答机制中起负向调节的功能，通过阻断PD-1与其受体PD-L1的结合，增强人体T细胞的激活来发挥其生物作用。2017年，陈艳新等[22]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人体T细胞系HuT-78中PDCD1基因，下调了PD-1的表达，因而减弱了PD-1/PD-L1信号通路对细胞免疫功能的抑制作用，使T细胞对肿瘤的杀伤能力不受影响，为未来肿瘤的免疫学治疗提供有力的技术支持。

综上所述，CRISPR/Cas9技术在未来肿瘤研究及治疗方面的发展潜力是无限的， 但是我们必须清醒地认识到，这项技术还存在很多尚未解决的问题，比如严重的脱靶效应，应用于人体时的伦理问题、安全性问题等。但可以预见的是，随着CRISPR/Cas9技术的不断创新最终会解决上述难题，为肿瘤的治疗研究提供新的思路和方向，为肿瘤患者带去新希望。