嵌合抗原受体T细胞制备及临床应用的影响因素研究进展

周祺祺，孙倩，王先火，张会来

(1 天津医科大学肿瘤医院/国家肿瘤临床医学研究中心/天津市“肿瘤防治”重点实验室/天津市恶性肿瘤临床医学研究中心/中美淋巴瘤诊治中心，天津300060；2 天津医科大学肿瘤医院生物技术研究室/天津市肿瘤免疫与生物治疗重点实验室)

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞移植疗法是当下肿瘤免疫治疗的热点之一。自2012年起，CAR-T细胞移植疗法先后在急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤包括滤泡性淋巴瘤(FL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的治疗中取得前所未有的成功，随后被美国FDA批准为B细胞ALL和复发难治性大B细胞淋巴瘤的三线治疗。目前全球有超过100项针对不同靶点的CAR-T细胞的临床实验[1]正在进行。尽管CAR-T细胞移植疗法能使众多复发难治性肿瘤患者再次获得缓解，但仍有30%～50%的肿瘤患者在接受CAR-T细胞移植疗法治疗后1年内出现疾病进展或复发[2,3]，有10%～20%的患者在接受CAR-T细胞移植疗法治疗后未得到缓解[2～4]。这些研究结果提示，应用CAR-T细胞移植疗法治疗肿瘤仍然存在诸多挑战，其中CAR-T细胞的成功制备、成功移植都会影响其治疗效果，而CAR-T细胞的成功制备、成功移植受许多因素的影响。现将CAR-T细胞制备及临床应用的影响因素研究进展情况综述如下。

1 CAR-T细胞制备的影响因素

CAR-T细胞制备的影响因素众多，其中患者T细胞采集数、患者T细胞质量、CAR-T细胞的体外扩增、CD4+/CD8+T细胞、起始T细胞表型、嵌合抗原受体(CAR)结构的构建等影响因素的研究较受关注。

1.1 患者T细胞采集数 考虑到恶性肿瘤的高侵袭性，成功制备和及时回输CAR-T细胞是确保该疗法有效实施的重要决定因素。CAR-T细胞制备的首要步骤就是采集患者的T细胞。由于多数患者曾接受具有细胞毒性反应的治疗，常常导致患者达不到CAR-T细胞移植疗法治疗前所要求的T细胞数，而不得不放弃该治疗。而一些患者即使能够采集足够数量的T细胞，如果没有成功制备出相应CAR-T细胞，也无法接受治疗。在一项针对CD19 CAR-T细胞移植疗法治疗的Ⅰ期临床实验中[4]，儿童的筛选标准规定中位基线绝对淋巴细胞计数(ALCs)为1 288/μL(168～4 488/μL)，该标准表明目前CAR-T细胞移植疗法治疗相关临床实验倾向于选择ALCs处于正常生理范围的患者，以此筛除T细胞采集数不足的患者。而在另一项CAR-T细胞相关临床实验[5]中，入组患者的中位CD3+细胞计数为567/μL(145～2 144/μL)，中位ALCs为775/μL(230～4 620/μL)。因此，采集足够数量的T细胞是接受CAR-T细胞移植疗法治疗的重要因素之一，而统一标准的筛选条件还需要参考更多的试验数据来明确。

1.2 患者T细胞质量 采集的T细胞质量也会影响CAR-T细胞的制备。报道[6]显示，采用接受过化疗(如含氯法拉滨、多柔比星的方案)的患者T细胞制备出的CAR-T细胞数量较少或质量较差。此外，在曾接受环磷酰胺和阿糖胞苷治疗的患者中观察到，T细胞亚群出现选择性减少[7]。所以尽量在患者接受化疗前采集足量健康的T细胞来制备CAR-T细胞，可以提升其质量。为解决上述问题，研究者们试图利用健康供体的T细胞作为替代来制备通用型CAR-T细胞，目前采用异体干细胞[8]制备CAR-T细胞的临床前研究[9]以及针对移植后复发肿瘤患者的临床实验正在进行中。研究[8]显示，采用异体干细胞制备CAR-T细胞的患者出现高级移植物抗宿主病(GVHD)的概率很低，证明了这种方法的可行性。第三方供体制备CAR-T细胞技术能够促进通用型CAR-T细胞产品的开发，从而使更多患者能够从中获益[10]。虽然制备这类细胞产品需要额外修饰基因来避免CAR-T细胞的排斥反应和GVHD的发生，但同时提供了克服CAR-T细胞移植疗法治疗耐药性机制的契机。

1.3 CAR-T细胞的体外扩增 CAR-T细胞需在体外进行扩增，以达到治疗所需细胞数量。目前有两种扩增方案用于制备FDA批准的CAR-T细胞产品[11,12]。一种是将CD3单克隆抗体加入培养液来刺激CAR-T细胞活化增殖；另一种是采用CD3/CD28抗体偶联磁珠直接对CAR-T细胞进行分离富集后，通过磁珠上的抗CD3和抗CD28抗体介导CAR-T细胞活化增殖。研究[13]发现，加入细胞因子(如IL-2、IL-7、IL-15)能够促进CAR-T细胞的体外扩增过程，而不同的细胞因子可能导致CAR-T细胞质量不同进而影响疗效，但目前尚未知何种细胞因子更具备优越性。

1.4 CD4+/CD8+T细胞 几乎所有CAR-T细胞产品都是由CD4+和CD8+T细胞共同产生，这两种细胞亚群可能都发挥着治疗作用。不同患者的CD4+/CD8+T细胞存在较大差异，这也可能影响CAR-T细胞的疗效。一些临床前研究[4,14]将CD4+T细胞和CD8+T细胞分别单独制备的CAR-T细胞以固定的比例回输给患者，结果发现患者的疗效提高。但目前有关不同CD4+/CD8+T细胞的CAR-T细胞疗效差异的研究尚未见报道。

1.5 起始T细胞表型 起始T细胞表型也是决定CAR-T细胞临床疗效的重要因素之一。在一项CD19 CAR-T治疗CLL患者的临床实验[15]中，研究者在治疗有效的患者体内发现了富含表达记忆相关基因的CAR-T细胞群，他们相较无应答者具有数量更多的高表达IL-6受体的CD27+PD-1-CD8+CAR-T细胞。因此筛选具有特定表型的起始T细胞有可能提高CAR-T细胞制备成功率和疗效[16]。

1.6 CAR结构的构建 构建CAR结构的方法不同也会影响CAR-T细胞特性，如扩增动力学、持续时间以及后续疗效。目前大多数临床实验采用的是第二代CAR-T细胞，它在第一代CAR-T细胞CD3ζ链的基础上增加了单一共刺激结构域CD28或4-1BB[17]。采用逆转录病毒载体或慢病毒载体构建出的不同CAR结构会影响其基因转染效率进而影响CAR-T细胞的活性。在FDA已批准的CAR-T细胞产品以及大多数临床实验中均采用逆转录病毒载体将CAR基因片段插入T细胞基因组中来构建CAR结构。目前在一些临床实验[18]中，采用转座子系统实现了不依赖载体将CAR基因插入T细胞基因组并得到有活性的CAR-T细胞，证明了该方法的安全性和可行性[19]。

2 CAR-T细胞临床应用的影响因素

许多因素对CAR-T细胞的临床应用产生影响，其中对CAR-T细胞移植、CAR-T细胞的体内活化和扩增、CAR-T细胞治疗适应人群、肿瘤细胞抗原丢失或缺失、细胞因子释放综合征(CRS)等的研究较多。

2.1 CAR-T细胞移植 如果在患者发生疾病进展或严重并发症之前未能及时移植CAR-T细胞，会影响治疗的成功率。一项CD19 CAR-T细胞相关临床研究[3]中，92例患者采集了T细胞，有17例患者最终没有接受CAR-T细胞移植，有7例患者在CAR-T细胞移植前死亡，部分患者在治疗中出现不良事件(真菌疾病或GVHD)导致患者终止移植CAR-T细胞。在另一项研究[2]中，共有78例患者采集了T细胞，在67例进行CAR-T细胞制备的患者中有13例没有接受移植，原因包括部分CAR-T细胞制备失败以及部分患者病情加重而失去治疗机会。因此，缩短CAR-T细胞移植延迟就能使部分患者在发生疾病进展或严重并发症之前接受CAR-T细胞移植疗法治疗，从而增加CAR-T细胞移植疗法获益的人数。未来CAR-T细胞疗法的商业化以及更简化的制备方法有望降低因CAR-T细胞移植时间延迟、错失治疗时机导致治疗失败的概率。

2.2 CAR-T细胞的体内活化和扩增 临床研究[2～4]报道，CAR-T细胞移植疗法治疗所需的有效剂量非常小，目前的方案为患者每千克体质量输注(0.2～5.0)×106个CAR-T细胞或每次输注(0.1～2.5)×108个CAR-T细胞，因此回输后的体内细胞活化和指数扩增是至关重要的。其中，CAR-T细胞质量、初始T细胞表型、细胞因子等在CAR-T细胞体内扩增中起着重要作用，疾病负荷及[4]淋巴细胞清除率对CAR-T细胞的体内扩增也起到关键作用。临床通常采用氟达拉滨为主的药物清除淋巴细胞[14]来促进CAR-T细胞的体内扩增，然而氟达拉滨却可能引发CAR-T细胞相关神经毒性[20]，能否不依赖细胞毒性化学疗法来实现CAR-T细胞体内扩增仍有待研究。

2.3 CAR-T细胞移植疗法治疗适应人群 尽管CD19 CAR-T细胞治疗疗效较高，但能够接受这种疗法的患者十分有限。获取CAR-T细胞产品的治疗授权，要求机构必须具备遵守产品生产和管理规程并安全管理患者的能力，中国缺乏CAR-T细胞产品授权的癌症中心，大量患者没有机会接受相关治疗。此外，高昂的费用也严重阻碍了患者接受CAR-T细胞移植疗法治疗[21]。未来优化制备方法、降低成本将有助于解决费用和保险覆盖范围方面的问题，使更多的患者不再由于经济问题而无缘接受CAR-T细胞移植疗法治疗。虽然CAR-T细胞在治疗血液系统肿瘤时取得了较好的成绩，但在治疗实体瘤时还面临诸多挑战，例如实体瘤特异性靶点选择困难、肿瘤微环境等因素，会抑制CAR-T细胞的活化扩增、效能以及致死等严重不良反应[22]等，这些因素导致实体瘤患者群体目前难以从CAR-T细胞移植疗法治疗中获益。

2.4 肿瘤细胞抗原丢失或缺失 靶抗原丢失是引起CAR-T细胞移植疗法治疗后疾病复发的潜在因素之一。目前已知的CD19抗原丢失的机制是，基因选择性剪接导致细胞表面CD19表达降低或翻译出异型CD19蛋白破坏靶表位[23]。当肿瘤细胞表面抗原表达量减少或密度下降至一定程度时，肿瘤细胞即可逃避CAR-T细胞攻击而引起肿瘤复发，而个体间最低抗原密度阈值差异则是导致部分患者出现复发或耐药的原因之一[24]。虽然有研究[25]报道，部分患者存在CD19阴性的恶性B细胞的祖细胞，但实际只有很少的患者在诊断时检测出CD19阴性或少量表达CD19的恶性B细胞[26]，而在KMT2A(MLL)基因重排的ALL婴儿患者中常检测到CD22阴性的细胞亚群[27]，因此患者在接受CAR-T治疗前还应进行更加详细的抗原表达分析检测。目前流式细胞术在监测最小残留病灶、预测患者预后中扮演重要角色，当肿瘤负担较轻时则需要更复杂的流式细胞术门控方法及其他检测单细胞免疫表型特征的技术，来预测患者发生抗原丢失性肿瘤复发的风险。而对于那些CAR-T细胞疗法未完全消除但流式细胞术难以检测的恶性细胞群引起的肿瘤复发，可以通过采用辅助PCR技术以及免疫球蛋白重链(IgH)VDJ重排分子评估技术随时间追踪肿瘤细胞来预测。鉴于抗原丢失是导致肿瘤细胞逃逸CAR-T细胞移植疗法治疗的重要机制之一，研究者们尝试构建多抗原靶向的CAR结构以应对肿瘤的固有异质性并试图以此降低疾病复发的可能。现已有证明多靶点CAR结构有效性的临床前数据发表[28]，同时相关临床实验也正在进行中。

2.5 细胞因子释放综合征(CRS) CRS是CAR-T细胞移植疗法治疗最常见的相关毒性反应[24,29,30]。目前CRS临床管理指南的制定主要参考了CD19 CAR-T细胞的临床实验结果，但不同靶向抗原的CAR-T细胞引起的CRS相关临床特征不尽相同，例如在接受CD22 CAR-T细胞移植疗法治疗的患者中观察到的CRS反应不似在CD19 CAR-T细胞移植疗法治疗中严重[24]，但CD22 CAR-T细胞移植疗法治疗会引发如凝血病等其他毒性反应，因此应对CAR-T细胞移植疗法治疗的毒性反应的干预策略应更具有针对性。目前数据表明早期干预可以在有效地降低CRS的严重程度的同时不破坏CAR-T细胞扩增峰值及疗效的持久性，但是这一数据仅来自采用一种CAR结构的单一试验，因此可能需要开展更多的研究来证实。未来，如何在发挥CAR-T细胞疗效最大化的前提下，寻找最佳干预措施及最佳干预时机来减轻或避免CRS等毒性反应将是一个极具挑战性的研究课题。目前一项关于研究托珠单抗联合抗IL-6疗法治疗CD19 CAR-T细胞相关CRS最佳时机的临床实验正在进行中。

综上所述，CAR-T细胞移植疗法治疗是目前极具前景的肿瘤免疫疗法之一，在筛选患者、采集T细胞、制备CAR-T细胞、CAR-T细胞体外扩增、移植CAR-T细胞、CAR-T细胞体内活化与扩增等实施CAR-T细胞移植疗法治疗的每一个步骤中都存在着能够影响最终治疗效果的因素。许多临床实验的结果显示，仍存在部分患者在接受CAR-T细胞移植疗法治疗后未能获得长期缓解，且CAR-T细胞移植疗法对于部分因肿瘤细胞抗原丢失而致复发的患者疗效甚微。与此同时，CAR-T细胞的毒性反应也限制了其广泛应用。但正是这些影响因素提示人们更加有方向性地探索CAR-T细胞移植疗法所面临的问题。在这个快速发展的研究领域，人们更加应该将研究重点落在克服已发现的问题上，这样在不久的将来CAR-T细胞移植疗法将会得到更广泛地应用。