miR-20b在人骨肉瘤细胞中的表达及对Saos-2细胞增殖、侵袭能力的影响观察

聂琨，汪阳

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院，武汉430014)

骨肉瘤起源于间充质细胞，好发生于股骨、胫骨、肱骨等部位，是严重影响青少年和老年人的骨科常见恶性肿瘤[1]。微小RNA(miRNA)是一类长度20～23 nt的单链RNA分子，在多种肿瘤生物学过程中调控基因表达[2]。研究[3,4]显示，miRNA在肿瘤发生发展过程中，如细胞周期、炎症、应激反应、增殖、转移、凋亡等过程中起重要调控作用。研究[5～7]发现，miR-20b在乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤等肿瘤中异常表达。但是，关于miR-20b在骨肉瘤中的表达及其功能的研究较少。2018年1月～2019年3月，我们观察了miR-20b在不同人骨肉瘤细胞系和正常成骨细胞系中的表达变化及沉默miR-20b对人骨肉瘤细胞系Saos-2增殖、侵袭能力的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人骨肉瘤细胞系Saos-2、U20S、143B及人正常成骨细胞系hFOB1.19均购自中国医学科学院细胞库，PTEN及GAPDH一抗均购自美国Invitrogen公司，二抗购自美国BD公司，LipofectamineTM2000 reagent购自美国Invitrogen公司，RT-PCR仪购自美国BD公司，HBS-1096B酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司，蛋白免疫印迹电泳设备购自美国Bio-Rad公司。miR-20b干扰序列miR-20b inhibitor和阴性对照序列scramble均由广州锐博生物科技有限公司设计合成。

1.2 人骨肉瘤细胞系及人正常成骨细胞系中miR-20b的检测 采用qRT-PCR法。Saos-2、U20S、143B细胞及hFOB1.19细胞均种植于RPMI1640培养基,在37 ℃、5%CO2条件下于培养箱中培养，待48 h后消化传代，取生长状态良好的细胞用于实验。采用All-in-One miRNA抽提试剂盒和All-in-One miRNA qRT-PCR检测试剂盒提取并分离RNA，采用Nano Drop 1000分光光度计对RNA的浓度进行测定，以U6为内参，进行荧光定量PCR反应。引物序列如下：miR-20b上游引物为5′-CUCCUAGAGCAGGUAG-3’，下游引物为5′-CUGCACUAGA-3′；U6上游引物为5′-ACTCCAGACATT-3′，下游引物为5′-CCCCTCACTT-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸20 s，40个循环。以2-ΔΔCt表示细胞中miR-20b的相对表达量。

1.3 Saos-2细胞的miR-20b干扰序列转染及转染后细胞增殖能力观察、侵袭能力观察、磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)蛋白检测

1.3.1 Saos-2细胞的miR-20b干扰序列转染及分组 将Saos-2细胞接种于12孔板上，分成miR-20b沉默组和阴性对照组，利用LipofectamineTM2000分别转染miR-20b干扰序列miR-20b inhibitor和阴性对照序列scramble，转染浓度为300 nmol/孔。两组细胞转染24h后，参照“1.2”检测转染后两组细胞中miR-20b的相对表达量。

1.3.2 转染后两组Saos-2细胞增殖能力观察 采用MTT法。将两组细胞消化成单细胞悬液后，以2×103个/孔将细胞种植于96孔板上，每孔按200 μL的体积上样，于培养0、24、48、72、96、120 h时，在每孔中加入20 μL MTT溶液，培养1 h后，采用酶标仪测定450 nm波长下的各孔的光密度值(OD值)，以OD值表示细胞增殖能力。

1.3.3 转染后两组Saos-2细胞侵袭能力观察 采用Transwell实验。按2×104个细胞的标准将两组细胞接种在碳酸磷脂表面，培养条件为37 ℃，培养时间为24 h，用1%多聚甲醛固定膜下的细胞，采用0.2%结晶紫溶液染色，在200倍镜视野下随机取10个视野，计算穿膜细胞数，以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。实验重复3次，取平均值。

1.3.4 转染后两组Saos-2细胞PTEN蛋白检测 采用Western Blotting法。将两组细胞裂解、变性后上样，上样量为每孔30 μg蛋白，浓缩胶条件为80 V 50 min，分离胶条件为100 V 100min，常规转膜，加入PTEN及GAPDH一抗，抗体浓度为1∶200，于4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶500)，37 ℃条件下孵育4 h后，漂洗3次，并经ECL液显影，采用Quantity One 1-D软件计算目标蛋白灰度值。目标蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/GAPDH灰度值。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 人骨肉瘤细胞系及人正常成骨细胞系中miR-20b相对表达量比较 人骨肉瘤细胞系Saos-2、U20S、143B及人正常成骨细胞系hFOB1.19中miR-20b的相对表达量分别为3.31±0.26、2.57±0.23、2.03±0.21和1.00±0.02，人骨肉瘤细胞系Saos-2、U20S、143B中miR-20b的相对表达量与正常成骨细胞系hFOB1.19相比，P均<0.01。

2.2 转染后两组Saos-2细胞中miR-20b相对表达量比较 miR-20b沉默组Saos-2细胞中miR-20b相对表达量为0.12±0.01，阴性对照组为1.00±0.03，两组相比，P<0.01，提示沉默miR-20b的Saos-2细胞模型成功建立。

2.3 转染后两组Saos-2细胞增殖能力比较 miR-20b沉默组培养0、24、48、72、96、120 h时的OD值分别为0.29±0.02、0.39±0.03、0.62±0.06、0.89±0.07、1.34±0.11、2.02±0.17，阴性对照组培养0、24、48、72、96、120 h时的OD值分别为0.28±0.02、0.49±0.05、1.05±0.08、1.63±0.12、2.57±0.19、3.69±0.25，两组细胞培养48、72、96、120 h时的OD值相比，P均<0.05。

2.4 转染后两组Saos-2细胞侵袭能力比较 miR-20b沉默组穿膜细胞数为(32.5±3.7)个，阴性对照组穿膜细胞数为(73.6±6.8)个，两组相比，P<0.01。

2.5 转染后两组Saos-2细胞中PTEN蛋白相对表达量比较 miR-20b沉默组细胞PTEN蛋白相对表达量为2.37±0.15，阴性对照组细胞PTEN蛋白相对表达量为1.00±0.02，两组相比，P<0.01。

3 讨论

研究[8]显示，骨肉瘤好发于儿童和青少年，极易转移至骨骼、肺部等，预后较差。近年来，由于化疗及手术技术的发展，骨肉瘤患者5年生存率提高至60%～70%[9]。然而，目前对于转移和复发的骨肉瘤疗效仍不理想。研究[10]表明，miRNAs在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。miRNAs可靶向结合目标基因，并调控下游信号通路，从而影响肿瘤生物学行为[11]。miRNA对靶基因的调控一般是通过其5′末端与靶基因mRNA 3′端UTR部分碱基互补配对实现的，如果靶基因是抑癌或致癌因子，那么miRNA很可能影响癌变[12]。目前，miRNA与骨肉瘤发生发展关系的已有相关研究，如miR-143靶向MMP-13调控骨肉瘤转移[13]，miR-199a-3p低表达于骨肉瘤组织且影响骨肉瘤细胞增殖和迁移[14]，miR-221通过影响PI3K/Akt信号通路影响骨肉瘤细胞凋亡和顺铂耐药性[15]。

目前，miR-20b已被发现在多种肿瘤类型中高表达，如乳腺癌[16]、肝癌[17]等，但是在膀胱癌[18]、肾癌[19]中低表达，表明miR-20b表达具有组织特异性，可能在不同肿瘤中发挥抑癌或促癌功能。Zhou等[16]指出miR-20b过表达促进乳腺癌细胞增殖、克隆形成、DNA合成，而敲除后则抑制肿瘤细胞生长。Wang等[20]发现，miR-20b表达上调促进食管癌Eca-109细胞迁移、侵袭和增殖，同时抑制细胞凋亡，其机制可能与下调PTEN表达有关。在膀胱癌中，miR-20b靶向调控Sp-1介导的MMP-2表达，抑制EJ细胞生长和致瘤性[18]。本研究中，通过qRT-PCR检测发现，人骨肉瘤细胞系Saos-2、U20S、143B中miR-20b异常高表达，提示miR-20b可能在骨肉瘤发生发展中起促癌基因的作用。本研究随后的功能缺失研究表明，miR-20b沉默显著抑制骨肉瘤Saos-2细胞的增殖和侵袭能力，与相关研究结果一致。

PTEN基因定位于染色体10q23，是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族成员，影响细胞生长、黏附、转移、侵袭、凋亡等多种生物学过程，目前已被证实与骨肉瘤、前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展相关[21]。研究[22]显示，在细胞水平，PTEN蛋白具有双特异性(蛋白质和脂肪)磷酸酶活性，能够将三磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化至二磷酸磷脂酰肌醇，以维持三磷酸磷脂酰肌醇处于低水平状态，进而抑制PI3K/Akt信号途径及维持正常的细胞周期。PI3K/Akt信号途径在肿瘤细胞中往往处于激活状态，通过激活与细胞免疫、增殖、凋亡、存活等基因的转录过程，促进肿瘤发展[23]。此外，PTEN蛋白缺失还可促进TGF-β诱导的细胞运动和侵袭[24]。另外，多个miRNAs被发现直接或间接参与了PTEN表达的调控，干扰肿瘤生长、进展和转移，如miR-21过表达靶向PTEN有利于肝癌细胞生长、转移和侵袭[25]，miR-214靶向PTEN诱导卵巢癌细胞存活及顺铂耐药性[26]，miR-216a/217通过靶向PTEN和SMAD7激活PI3K/AKT和TGF-β信号途径，导致肝癌形成和复发[27]。本研究中miR-20b沉默后PTEN蛋白表达水平升高，推测在骨肉瘤细胞中miR-20b沉默后结合PTEN mRNA 3′端UTR能力下降，PTEN翻译水平增高，表达增加，进而抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭。

综上所述，miR-20b在人骨肉瘤细胞系中高表达；沉默miR-20b可抑制人骨肉瘤细胞系Saos-2的增殖和侵袭能力，其机制可能与上调PTEN蛋白表达有关，这为深入阐明和理解骨肉瘤的发生机制提供一定的参考，并可能成为新的治疗靶点。