外源性锌离子培养/低氧环境下大鼠Müller细胞活力、锌离子浓度变化及促红细胞生成素的调节作用观察

康道欢，史彩平

(浙江大学医学院附属儿童医院/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，杭州310003)

锌离子在视网膜上的含量较高，主要分布于视网膜色素上皮细胞和胶质细胞，并且在调节突触传递、抗氧化应激反应中起重要作用。研究[1]表明，暗适应的破坏、黄斑变性等与人体内锌离子缺乏导致的视网膜抗氧化剂减少有关。锌离子同样可以降低糖尿病患者中脂质过氧化反应和谷胱甘肽水平[2]。研究[3]表明，促红细胞生成素(EPO)具有保护缺氧状态下视网膜神经和血管的作用，EPO可以通过抑制HIF-1α的表达起抗VEGF的作用[4]。研究[5]发现，EPO及其受体在视网膜中表达，并且EPO对视网膜神经节细胞的保护存在剂量关系。在低氧诱导的视网膜中，EPO通过抗凋亡途径来保护一过性缺血缺氧和再灌注损伤，同时EPO还可以通过降低炎性因子(TNF-α、IL-1β)的表达改善缺氧性视网膜病变中的炎性反应[6]。锌离子转运体8(ZnT8)在视网膜上表达，主要表达于视网膜色素上皮细胞、Müller细胞。已有文献报道ZnT8在糖尿病患者静脉血[7]及糖尿病大鼠视网膜中的表达下降，并且抑制HIF-1α的表达可以增加ZnT8的表达。本研究通过在大鼠Müller细胞系rMC-1中加入氯化锌(ZnCl2)及EPO，观察外源性锌离子、EPO对大鼠Müller细胞系rMC-1细胞活力、细胞凋亡率影响，并在此基础上，通过在rMC-1细胞中加入氯化钴(CoCl2)诱导低氧环境[8]，观察低氧环境、EPO对rMC-1细胞中锌离子浓度、ZnT8表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 加入外源性锌离子培养的大鼠Müller细胞系rMC-1细胞活力及EPO调节作用观察

1.1.1 细胞培养、分组及锌离子和EPO的给予 取冻存于液氮中的rMC-1细胞置于37 ℃水浴锅中解冻1 min后，转移到含9 mL DMEM+10%血清+1% P/S培养基的培养皿中，置于37 ℃培养箱中传代培养3～4代。取生长状态良好的rMC-1细胞，按1 000个/孔接种于96孔板中，分成3组，分别记为ZnCl2组、ZnCl2+EPO组、正常对照组，分别加入ZnCl2、ZnCl2+EPO、等量培养基，每组设6个复孔。ZnCl2组ZnCl2终浓度为125 μmol/L，ZnCl2+EPO组ZnCl2终浓度为125 μmol/L、EPO的终浓度为40 U/mL。

1.1.2 ZnCl2组、ZnCl2+EPO组、正常对照组细胞活力观察 采用MTT法。各组细胞继续培养24 h后，PBS清洗一次，加入0.5 mg/mL的MTT溶液孵育4 h，移去上清液，保留结晶体，每孔加入100 uL DMSO，37 ℃摇床低速振荡10 min，选择490 nm为主波长，570 nm为参比波长，在酶标仪上测定各孔的光密度值(OD值)，计算细胞活力。细胞活力=OD值(490 nm)/OD值(570 nm)。实验重复3次，取平均值。

1.1.3 ZnCl2组、ZnCl2+EPO组、正常对照组细胞凋亡率观察 采用TUNEL法。各组细胞继续培养24 h后，PBS漂洗细胞2次，蛋白酶K(20 μg/mL)室温孵育5 min，PBS漂洗2次；加入50 μL TUNEL反应混合液于标本上，在37 ℃暗湿盒中孵育1 h；PBS漂洗2次，DAPI(2 μg/mL)室温下孵育5 min染核，荧光显微镜下观察，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=荧光细胞数/总细胞数×100%。

1.2 低氧环境下大鼠Müller细胞系rMC-1细胞内锌离子浓度变化及EPO的调节作用观察

1.2.1 细胞培养、分组及CoCl2和EPO的给予 取冻存于液氮中的rMC-1细胞置于37 ℃水浴锅中解冻1 min，解冻后转移到含9 mL DMEM+10%血清+1% P/S培养基的培养皿中，置于37 ℃培养箱中传代培养3～4代。取生长状态良好的rMC-1细胞接种于盖玻片上，分成3组，分别记为CoCl2组、CoCl2+EPO组、正常对照组，分别加入CoCl2(诱导低氧环境)、CoCl2+EPO、等量培养基。CoCl2组CoCl2终浓度为200 μmol/L，CoCl2+EPO组CoCl2终浓度为200 μmol/L、EPO的终浓度为40 U/mL。

1.2.2 CoCl2组、CoCl2+EPO组、正常对照组锌离子浓度观察 采用锌离子探针FluoZin-3 AM检测低氧环境及EPO对rMC-1细胞内锌离子浓度的影响。各组细胞继续培养24 h后，在37 ℃条件下加入FluoZin-3 AM(5 μmol/L)孵育1 h，PBS清洗1次，然后将盖玻片换成新鲜培养基，37 ℃下继续培养30 min，DAPI染核5 min，PBS清洗3次，每次5 min，DAKO封片，荧光显微镜下观察各组细胞的荧光情况。取1×105个rMC-1细胞于荧光比色杯中，用荧光分光光度计检测在激发波长为365/490 nm处的荧光强度，以荧光强度表示细胞内锌离子浓度。

1.2.3 CoCl2组、CoCl2+EPO组、正常对照组rMC-1细胞内ZnT8表达影响观察 ①采用qRT-PCR法检测各组rMC-1细胞内ZnT8 mRNA。各组细胞继续培养24 h后，弃培养基后用蛋白酶溶解收集细胞，TRIzol试剂提取RNA，取500 ng RNA逆转录成cDNA，逆转录条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA作为模板，进行PCR扩增，PCR总反应体积20 μL。引物序列如下：ZnT8正向引物为5′-AAGTGGAGACTCTGTGCTGCTTCA-3′,反向引物为5′-GGCCTCGATGACAACCACAAAGAA-3′,β-actin正向引物为5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′,反向引物为5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′。PCR扩增条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，60 ℃继续延伸40 s，共39循环。以2-ΔΔCt表示细胞中ZnT8 mRNA的相对表达量。②采用Western blotting法检测各组rMC-1细胞内ZnT8 蛋白。各组细胞继续培养24 h后，弃培养基后用蛋白酶溶解收集细胞，加入组织蛋白抽提液提取蛋白，BCA法测蛋白浓度；取配制好的10%的胶，以每泳道40 mg蛋白进行电泳分离，电泳条件为80 V 30 min，120 V 1 h，4 ℃下300 mA 2 h转至PVDF膜上，5% PBS脱脂牛奶封闭30 min，加入一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，Odyssey Infrared Imaging系统计算细胞中ZnT8蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 ZnCl2组、ZnCl2+EPO组、正常对照组rMC-1细胞活力及凋亡率比较 ZnCl2组、ZnCl2+EPO组、正常对照组rMC-1细胞活力分别为0.252±0.034、0.342±0.031、0.513±0.040，组间相比，P均<0.05，说明rMC-1细胞在外源性锌离子处理后活力下降，EPO治疗具有保护作用。

ZnCl2组、ZnCl2+EPO组、正常对照组rMC-1细胞凋亡率分别为60.326%±5.230%、28.268%±3.756%、15.124%±3.521%，组间相比，P均<0.01。

2.2 CoCl2组、CoCl2+EPO组、正常对照组rMC-1细胞中锌离子浓度、ZnT8表达比较 CoCl2组、CoCl2+EPO组、正常对照组rMC-1细胞内锌离子浓度分别为6.712%±1.251%、4.723%±0.892%、3.428%±0.522%，组间相比，P均<0.05。

CoCl2组rMC-1细胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相对表达量分别为0.224±0.038、2.436±0.187，CoCl2+EPO组rMC-1细胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相对表达量分别为0.314±0.030、3.082±0.247，正常对照组rMC-1细胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相对表达量分别为0.385±0.025、3.583±0.256，组间相比，P均<0.01，说明rMC-1细胞中ZnT8 mRNA和蛋白的表达在CoCl2处理后表达下降，在EPO治疗后表达升高。

3 讨论

锌是人体内第2丰富的微量元素，并且是维持细胞正常功能的必须元素，在人体代谢中起重要作用，比如酶的合成、胰岛素的合成和释放等，同样在免疫反应、氧化应激、老化过程中起重要作用。锌离子丰富表达于视网膜色素上皮、脉络膜和神经视网膜，在视网膜中锌离子参与维持正常的视觉功能、调节突触传递和抗氧化应激作用，同时在视网膜生理、病理过程中起重要作用[9]。研究[7]表明，人体锌离子缺乏会导致的视网膜中抗氧化剂的减少进而导致暗适应的破坏、黄斑变性和白内障等。同时实验[10]表明，口服补锌治疗对早期糖尿病大鼠视网膜病变具有保护作用，然而在糖尿病视网膜病变晚期，视网膜缺氧条件下，锌离子的缺乏或超载，均对视网膜细胞具有毒害作用。同时已有许多研究[11,12]表明，细胞内锌离子蓄积对神经元、胶质细胞和其他细胞有毒害作用。我们实验也证实了锌离子蓄积对细胞的毒性作用，即在外源性锌离子处理后，rMC-1细胞活力下降、细胞凋亡率增加。同时EPO对外源性锌离子蓄积诱导的细胞毒性具有保护作用，即EPO治疗后细胞活力提高、细胞凋亡率显著减少。

本研究结果表明，低氧环境下rMC-1细胞内的锌离子浓度增加，同时缺氧状态下细胞内锌离子蓄积可能对细胞产生毒性作用，因此缺氧状态下锌离子蓄积产生的细胞毒害作用可能为缺氧性视网膜损伤的一个机制。此结果还需进一步实验验证。已有研究[3]表明，EPO具有保护缺氧状态下视网膜神经和血管的作用，EPO可以通过抑制HIF-1α的表达起到抗VEGF的作用、EPO可以通过降低缺氧条件下一些炎症因子(IL-2、TNF-α等)的表达发挥视网膜保护作用。EPO及其受体表达于Müller细胞上。为此，我们研究低氧状态下EPO对Müller细胞内锌离子是否有调控作用。我们的研究表明，EPO治疗可显著性减少低氧状态下细胞内锌离子的蓄积，即在低氧状态下细胞内锌离子浓度显著性增加，在EPO治疗后细胞内锌离子显著降低。综上，EPO通过降低缺氧状态下锌离子蓄积产生的细胞毒性作用，可能为EPO保护缺氧性视网膜病变的其中一个机制。

研究[2]表明，细胞内锌离子稳态是靠锌离子转运蛋白及锌结合蛋白维持的。锌离子转运蛋白主要分为ZnT(SLC30A)和ZIP(SLC39A)两大家族，ZnT的作用为转运细胞质内的锌离子到细胞外，ZIP的作用与ZnT正好相反，转运细胞外或细胞核内的锌离子到细胞质,这些转运蛋白在锌离子的调节过程中起重要作用。ZnT8广泛分布于视网膜中，主要表达于视网膜色素上皮细胞和Müller细胞中，其在调节细胞内锌离子的动态平衡中起着重要的作用。ZnT8丰富表达于Müller细胞中，其对锌离子的调控作用是把锌离子转移到细胞外或细胞核中，从而降低胞浆内锌离子浓度，且已有研究[2]表明低氧状态下Müller细胞内ZnT8表达降低。因此，我们检测EPO对低氧状态下ZnT8 mRNA及蛋白水平表达的影响。本研究结果表明，在CoCl2处理后，ZnT8 mRNA及蛋白水平的表达均显著降低，并且在EPO治疗后其表达显著增加。因此，EPO可以增加低氧状态下Müller细胞内ZnT8的表达。

综上所述，EPO对锌离子蓄积产生的细胞毒害作用如细胞活力降低、细胞凋亡率增加具有保护作用，EPO可减少低氧状态下rMC-1细胞内锌离子浓度，其机制可能与增加ZnT8表达有关。本细胞研究结果还需动物体内实验进一步验证，其它锌离子转运体ZnT3、ZnT6、Zip1、Zip2、Zip3等在低氧模型中是否改变及EPO调节ZnT8的信号通路也需进一步研究。