不同浓度维替泊芬对鼻咽癌细胞株CNE1增殖、侵袭、凋亡的影响及其机制

陈嵘，郑斯明，苏年华，左可军

(1 中山市人民医院，广东中山528403；2 中山大学附属第一医院)

鼻咽癌细胞常发生于鼻咽部黏膜上皮，发病部位解剖结构较复杂，为头颈部最常见的恶性肿瘤之一，其癌细胞病理分化程度低并且比较容易发生转移[1]。鼻咽癌高发于北非及东南亚，我国华南地区的发病率也较高，该病的致病因素至今未完全明了，可能与环境因素、遗传因素和EB病毒感染相关[2]。目前，鼻咽癌的主要治疗手段为放射治疗，但是大多数初诊患者已经发生局部或远处淋巴结转移，其疗效欠佳，患者治疗后可能会发生肿瘤复发及转移[3]。因此，探寻一种疗效显著、不良反应小的治疗方案迫在眉睫。维替泊芬是一种光学增强剂，美国FDA于2000年批准其应用于以脉络膜血管形成为主的老年黄斑相关疾病的临床治疗。近期多项研究[4]表明，维替泊芬具有杀伤肿瘤细胞的能力，具有良好的抗肿瘤效应。研究[5]表明，维替泊芬可特异性抑制癌蛋白YAP1，并影响肿瘤细胞中众多基因及信号通路的调控，介导肿瘤细胞生长相关基因及蛋白生成，抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。目前无维替泊芬对鼻咽癌细胞作用的相关研究报道。2018年10月～2019年4月，本研究观察了不同浓度的维替泊芬对鼻咽癌细胞株CNE1增殖、侵袭、凋亡、细胞周期的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及分组 CNE1细胞在含100 mg/L链霉素、100 mL/L血清和100 kU/L青霉素的DMEM培养基中培养，细胞增殖至密度达80%左右时，胰酶消化并传代培养。取对数生长期CNE1细胞分为实验组和对照组，实验组分别加入1、2、4 μmol/L的维替泊芬，记为A、B、C组，对照组加入等量培养基。

1.2 各组细胞增殖能力观察 采用CCK-8法。取各组细胞以6×103/孔接种于96孔板，每个浓度设置5个复孔，继续培养24、48 h后，加入CCK8溶液10 μL，培养箱中孵育4 h，以空白孔为空白组，酶标仪检测450 nm处的吸光度(OD)值，计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。以细胞存活率表示细胞增殖能力。

1.3 各组细胞克隆形成能力观察 采用细胞克隆形成实验。取各组细胞以500个/孔接种于6孔板中，于培养箱中继续培养10 d，去除6孔板中的培养基并用DPBS缓冲液冲洗干净，4%多聚甲醛固定30 min后冲洗干净，结晶紫溶液染色30 min，去除染色液后充分清洗干净，倒置显微镜下观察并计数细胞克隆形成个数(超过50个细胞的细胞团为一个细胞克隆)。以细胞克隆形成个数表示细胞克隆形成能力。

1.4 各组细胞侵袭能力观察 采用Transwell小室侵袭实验。Transwell小室经培养基湿润后包被Matrigel胶，于培养箱中放置30 min备用。取各组细胞重悬于无血清培养基并接种于上室，终体积为200 μL；下室中加入600 μL含10%胎牛血清的完全培养基，药物浓度与上室一致。在培养箱中培养24 h后取出小室，甲醇固定30 min，DPBS清洗2遍，加入结晶紫染色1 h，去除染色液后用棉签擦去残胶，DPBS洗涤3遍后干燥，100倍光镜下随机选择中央及四周5个视野计数侵袭细胞数，以侵袭细胞数表示细胞侵袭能力。实验重复3次，取平均值。

1.5 各组细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。取各组细胞以1×106/孔接种于6孔板中，继续培养24 h后，收集细胞并用PBS清洗3次，充分去除洗涤液后加入100 μL Binding buffer重悬，加入APC和PI各5 μL，常温下避光孵育30 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况：画十字门，记录各组十字门的第四象限细胞百分比。以第四象限细胞百分比表示各组细胞凋亡率。

1.6 各组细胞周期观察 采用流式细胞术。取各组细胞以1×106/孔接种于6孔板中，继续培养24 h后，收集细胞并用PBS清洗3次，充分去除洗涤液后加入75%乙醇固定，4 ℃存放24 h，PBS洗涤3次后加入500 μL PI重悬，4 ℃避光孵育30 min，使用流式细胞仪检测细胞周期。

1.7 B组及对照组细胞中YAP1、TEAD、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B细胞瘤-2(Bcl-2)、细胞周期素D1(CyclinD1)、髓细胞组织增生蛋白(MYC)、Axl mRNA及蛋白检测 ①采用实时荧光定量PCR法检测细胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA。取B组及对照组细胞继续培养24 h后，TRIzol裂解并提取细胞总RNA，将RNA逆转录成cDNA。以cDNA为模板，以GAPDH为内参，进行实时荧光定量PCR扩增。引物序列如下：YAP1上游引物为5′-GCCCAGTTATACCTCAGTGTTGTAG-3′，下游引物为5′-GGTCTCCTTCAGGTCAGTACAG-3′；TEAD上游引物为5′-GCCCATGTGCGAGTACCT-3′，下游引物为5′-TCCAGGACGCTGTTCATCA-3′；Caspase-3上游引物为5′-GGCTGAGCTGCCTGTAACTTG-3′，下游引物为5′-TGGCTCTGCCTTCATGGAAC-3′；Bcl-2上游引物为5′-GAGCACAGAAGATGGGAACACT-3′，下游引物为5′-AGGTGCATGGATTTACTCAGTATC-3′；Cyclin D1上游引物为5′-CTGGGTCTGTGCATTTCTGGTT-3′，下游引物为5′-CTGCTGGAAACATGCCGGTTA-3′；MYC上游引物为5′-CACATGCCCAAGATTCACTGATAG-3′，下游引物为5′-GAGGTGGCTTGGACAGGTTAG-3′；Axl上游引物为5′-CCACCTTTCGGGCCATGTT-3′，下游引物为5′-GAGGCACCAGAGTCCACACT-3′；GAPDH上游引物为5′-CCTGCACCACCAACTGCTTAG-3′，下游引物为5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。建立20 μL qRT-PCR扩增体系，包含TB Green混合物10 μL，DEPC水6.4 μL，cDNA 2 μL和相关基因上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共进行40个循环。用2-ΔΔCt表示细胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA的相对表达量。②采用Western Blotting法检测细胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl蛋白。取B组及对照组细胞继续培养24 h后，充分洗涤后用细胞裂解液4 ℃条件下充分裂解20 min，提取全细胞蛋白并用Bradford法测定蛋白浓度。选择合适浓度的SDS-PAGE胶，每个电泳通道加入30 μg蛋白，80 V恒压电泳0.5 h后，120 V电泳1 h，250 mA恒流湿转法转膜，将PVDF膜置于5%脱脂牛奶溶液中封闭1.5 h，分别将PVDF膜孵育相应一抗溶液，4 ℃摇床摇晃过夜，TBST溶液洗涤3次(10 min/次)，室温下二抗孵育1.5 h，TBST溶液漂洗二抗3次(10 min/次)，沥干后加入ECL发光液，于Tannon成像系统中显影，蛋白灰度值采用Image J软件计算。以目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 A、B、C及对照组细胞培养24 h时细胞存活率分别为85.27%±0.63%、74.18%±1.01%、57.67%±0.92%、100.00%±0.42%，组间相比，P均<0.05；A、B、C及对照组细胞培养48 h时细胞存活率分别为70.35%±0.61%、59.33%±1.27%、41.39%±0.46%、100.00%±0.85%，组间相比，P均<0.05；A、B、C组细胞在培养48 h时的细胞存活率，与24 h时相比，P均<0.05。

2.2 各组细胞克隆形成能力比较 A、B、C及对照组细胞克隆形成个数分别为183.67±12.92、118.67±10.50、47.33±5.31、253.67±8.18个，组间相比，P均<0.05。

2.3 各组细胞侵袭能力比较 A、B、C及对照组细胞侵袭细胞数分别为44.67±2.87、28.67±4.11、16.67±3.68、56.67±5.31个，组间相比，P均<0.05。

2.4 各组细胞凋亡率比较 A、B、C及对照组细胞凋亡率分别为14.52%±1.03%、26.56%±2.10%、38.64%±1.42%、5.31%±0.77%，组间相比，P均<0.05。

2.5 各组细胞周期比较 A组G2/M、S、G0/G1期细胞分别为15.46%±1.74%、42.37%±2.69%、42.17%±1.73%，B组G2/M、S、G0/G1期细胞分别为8.39%±0.77%、34.48%±0.57%、57.13%±0.39%，C组G2/M、S、G0/G1期细胞分别为3.82%±1.89%、26.16%±0.81%、70.02%±1.42%，对照组G2/M、S、G0/G1期细胞分别为21.52%±0.75%、53.14%±1.31%、25.34%±0.95%，各细胞周期比例组间相比，P均<0.05。

2.6 B组及对照组细胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA及蛋白相对表达量比较 ①B组细胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA的相对表达量分别为0.37±0.12、0.56±0.17、0.35±0.25、0.43±0.29、0.48±0.27、0.39±0.35、0.35±0.71，对照组细胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl mRNA的相对表达量分别为1.00±0.33、1.00±0.67、1.00±0.14、1.00±0.28、1.00±0.81、1.00±0.33、1.00±0.11，两组相比，P均<0.05。②B组细胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl蛋白的相对表达量分别为0.51±0.45、0.44±0.31、0.42±0.23、0.61±0.09、0.39±0.41、0.52±0.38、0.48±0.21，对照组细胞中YAP1、TEAD、caspase-3、Bcl-2、CyclinD1、MYC、Axl蛋白的相对表达量分别为1.00±0.56、1.00±0.82、1.00±0.73、1.00±0.32、1.00±0.34、1.00±0.14、1.00±0.29，两组相比，P均<0.05。

3 讨论

鼻咽癌是人类常见恶性肿瘤之一，复发及癌细胞转移是患者死亡的主要原因，目前治疗手段有限。近年来，恶性肿瘤的分子靶向精准治疗取得了较大进步。多项研究[6]表明，Hippo通路参与了肿瘤细胞的发生发展。Hippo通路调节着细胞生存，从而影响组织及器官发育。Hippo通路中核心转录共刺激因子YAP1可通过磷酸化及去磷酸化调节并参与细胞中一系列的转录活动[7]。多项研究[8]表明，YAP1在多种恶性肿瘤细胞中过表达，并且调节着癌细胞增殖、生存及侵袭能力。Song等[7]研究发现，鼻咽癌患者的鼻咽组织中YAP1表达量远远高于健康供者，提示癌蛋白YAP1是鼻咽癌潜在的治疗新靶点，为靶向精准治疗药物开发拓展新方向。本研究结果显示，加入不同浓度的维替泊芬后，鼻咽癌细胞株CNE1的增殖能力、克隆形成能力、侵袭能力显著下降，细胞凋亡率升高，阻滞其生长周期，且维替泊芬对CNE1细胞的调节作用存在一定的浓度依赖性。

Brodowska等[9]发现，YAP可以与TEAD形成TEAD-YAP复合物，共同调节下游原癌基因c-myc、Axl以及细胞迁移和血管生成因子等表达，维替泊芬可抑制YAP-TEAD复合物的形成并阻断下游因子的表达，从而杀伤视网膜母细胞瘤细胞。研究[10]显示，YAP可通过TEAD直接激活Pik3cb表达并诱导PI3K转录，进而活化PI3K/AKT通路，YAP通过AKT途径增强肝癌细胞的增殖能力。进一步研究[11]发现，AKT抑制剂可抑制YAP1的活性并减弱结缔组织生长因子的翻译活性，激活肝癌细胞程序性细胞死亡并抑制肿瘤细胞的生存能力。Wei等[12]发现，YAP1抑制剂维替泊芬可促进胰腺癌细胞凋亡，其抗胰腺癌活性与肿瘤细胞中的Bcl-2蛋白表达升高相关，进一步研究发现胰腺癌细胞中多种蛋白水解酶对静息状态的caspase-3酶原进行水解，激活caspase-3剪切酶，加强维替泊芬杀伤肿瘤细胞能力。研究[13]显示，YAP1抑制剂维替泊芬可促进前列腺癌细胞及胰腺癌细胞的凋亡，同时抑制肿瘤细胞的生长周期，其机制与抗凋亡蛋白Bcl-2、MYC、caspase-3、Cyclin D1表达有关。本研究结果同样表明，维替泊芬可通过激活及裂解caspase-3并抑制Bcl-2蛋白表达，诱导鼻咽癌细胞凋亡。

本研究结果显示，维替泊芬抑制鼻咽癌细胞生长周期进展，将CNE1细胞阻滞于G0/G1期，减少S期及G2/M期比例，阻滞细胞增殖。前期研究[14]发现，维替泊芬作用于白血病细胞后可抑制YAP和TEAD蛋白的相互作用，促进YAP和TEAD蛋白的降解，并且抑制CyclinD1蛋白的翻译活动，将白血病细胞周期阻滞于G0/G1期，降低S期和G2/M期的细胞数，抑制白血病细胞增殖率。本研究发现，维替泊芬可减弱鼻咽癌细胞中的YAP和TEAD蛋白复合体的相互作用，抑制其转录及翻译水平，促进蛋白质降解。同时减少细胞中CyclinD1蛋白表达量，抑制鼻咽癌细胞从G1期向S期转化，阻滞细胞周期于G0/G1期，降低鼻咽癌细胞中DNA合成量，从而抑制鼻咽癌细胞的生存及增殖能力。

综上所述，1、2、4 μmol/L的维替泊芬均可抑制CNE1细胞的增殖、侵袭能力，诱导细胞凋亡，阻滞生长周期，且调节作用与维替泊芬的浓度有关；维替泊芬调控CNE1细胞增殖、侵袭、凋亡和细胞周期的作用机制可能与抑制YAP1及其下游因子的表达有关。本研究一定程度上为鼻咽癌在分子靶向精准治疗方面提供了理论支撑，为鼻咽癌患者的治疗提供了新选择及新希望。