P2X7受体与白血病关系的研究进展

李明萱，罗淑萍，赵荣兰，彭效祥

(潍坊医学院 临床检验诊断学山东省“十二五”高校重点实验室，山东潍坊261053)

ATP作为一种核苷酸，可参与细胞间信号转导，其受体被命名为2型嘌呤能受体家族(P2)受体，其中嘌呤能离子通道型7(P2X7)受体的生理功能有着重要意义，免疫学研究也最广泛[1]。P2X7受体广泛表达于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞等多种免疫细胞，在免疫反应中发挥重要作用。P2X7受体激活的失衡可能导致多种病理反应，包括感染、炎症性疾病、神经退行性疾病和癌症等。研究表明，P2X7受体的激活可以加快或改善疾病进程[2]。近年来，P2X7受体在白血病发生发展中的作用越来越受到关注，P2X7受体在白血病患者特别是复发患者的骨髓单核细胞中高表达，表明P2X7受体的过度表达可能是一个不良的预后因素。P2X7受体激活后可促进白血病细胞增殖或引发细胞死亡，因此P2X7受体介导的嘌呤能信号通路是治疗白血病的潜在药物靶点。本文就P2X7受体在白血病中的作用及其机制的研究进展予以综述，以期为白血病治疗提供新靶点和新策略。

1 P2X7受体的基本结构和特征

P2X7受体包括一个由285个氨基酸组成的庞大、糖基化和富含半胱氨酸的胞外结构域，两个跨膜的TM1和TM2结构域，一个短的胞内N末端和一个胞内长C末端。其中人P2X7受体中的TM1和TM2结构域分别由残基T28-S47和N332-L354组成[3]。与其他P2X受体相比，P2X7受体具有长的胞内C末端，它参与了与P2X7受体相关的大部分功能，该区域不同部位的突变与多种生理功能的丧失有关，如脂多糖的结合、翻译后修饰、膜靶向和大孔的形成等[4]。尽管少量证据表明P2X7受体可能聚集形成六聚体，但大量证据支持三聚体结构[5]。

2 P2X7受体的基本功能

P2X7受体是一种ATP门控阳离子通道，在短暂刺激下形成选择性阳离子通道，允许Na+、Ca2+和K+的内流。P2X7受体激活后可产生促进和抑制效应，主要依赖于激动剂刺激的强度和持续时间、细胞类型、细胞外离子浓度和基因多态性等。P2X7受体在淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞的活化和树突状细胞免疫应答的启动中起重要作用[6]。P2X7受体参与IL-18分泌和单核细胞中IL-1β的成熟和释放，以及巨噬细胞自噬作用的调控。此外，P2X7受体在激活T细胞和抑制调节性T细胞(Tregs)的免疫抑制潜力方面发挥了重要作用[7]。P2X7受体的激活是免疫细胞凋亡的重要机制，包括胸腺细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞。细胞间联系能够产生足够的细胞外ATP来激活P2X7受体和触发下游信号通路，包括膜金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶(Caspases)，最终导致靶细胞凋亡。在P2X受体中，P2X7受体表现为双功能分子：低浓度的ATP打开阳离子通道会导致细胞增殖，而高浓度的ATP打开大孔释放炎性细胞因子，可导致细胞凋亡[5,8,9]。大孔道负责大多数P2X7受体依赖性的功能，以前认为大孔道并非P2X7受体本身所固有，其形成需要辅助蛋白的参与和持续的刺激。2017年的研究表明，大孔道是P2X7受体固有的，受体受到刺激后立即被激活。近年研究发现，这个孔道的打开与它独特的C端无关，P2X7受体通道的活性主要取决于胆固醇与跨膜区结构域的直接相互作用，但磷脂酰甘油和鞘磷脂也有促进作用[10,11]。恶性肿瘤普遍过表达P2X7受体，是P2X7受体发挥双重功能的典型代表。

3 P2X7受体在白血病发病中的作用

3.1 P2X7受体参与白血病细胞增殖 在P2X受体亚群中，P2X7受体与细胞增殖的关系最密切[11]。以往研究显示，在不表达P2X7受体的白血病细胞系K562和LG14中，过表达P2X7受体可促进细胞增殖。此外，急性淋巴细胞白血病和其他类型白血病患者骨髓来源的单个核细胞中，P2X7受体的表达明显高于健康对照组。在慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)中，P2X7受体表达与发病率的增加相关，这表明P2X7受体赋予肿瘤细胞生长优势。正常T细胞受到抗原刺激后会释放大量ATP到胞外，刺激P2X受体激活自分泌信号通路调节钙离子内流，产生包括细胞增殖在内的多种功能。Ledderose等[12]提出嘌呤能信号转导机制中的缺陷是否与白血病T细胞的有害增殖有关，他们发现与正常T细胞相比，急性白血病T细胞(Jurkat)拥有数量庞大、活性更高的线粒体，并且与未受刺激的正常T细胞相比，Jurkat胞内ATP浓度更高，释放更多的ATP，由此导致的自分泌嘌呤能信号转导的增强可维持线粒体的高活性，构成了一个反馈回路；进一步研究发现，基础性ATP持续刺激P2X1和P2X7受体导致了嘌呤能信号转导机制的紊乱，进而造成了白血病细胞的无限增殖，在白血病细胞系THP-1、U-937和HL-60也观察到不同程度的大量增殖现象。另外，不同于正常T细胞，上述白血病细胞系的增殖不需TCR/CD28 的刺激。进一步研究发现，进展型B-CLL的静息钙离子浓度显著高于懒惰型，并且前者P2X7受体激活会触发更多的钙离子内流。高水平的钙离子内流与进展型B-CLL患者淋巴细胞P2X7受体表达增加有关。ATP培养可以减少进展型患者淋巴细胞的自发性增殖，但对懒惰型患者的淋巴细胞没有影响，表明 P2X7受体的表达赋予进展型B-CLL细胞增殖优势，但也使这些细胞更容易受到胞外高浓度ATP的细胞毒性作用的影响。另一方面，这些结果提示P2X7受体的表达和功能可能与B-CLL的预后有关[13]。P2X7受体在CLL患者的外周血淋巴细胞中过表达。Salaro等[14]研究了23例CLL患者的淋巴细胞P2X7-炎性复合体隐热蛋白(NLRP3)轴，发现P2X7受体和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)均过表达，而NLRP3与正常对照相比显著下调；进一步研究发现，NLRP3沉默会增强P2X7受体的表达和促进细胞生长，相反NLRP3过表达会刺激Caspase的活性而加速细胞死亡；这些发现提示，NLRP3是生长的负调控因子，并指出了P2X7/NLRP3轴在CLL中的作用。研究表明，所有造血细胞均表达P2X7受体，然而不同谱系和不同分化阶段的细胞表达水平不同；造血干细胞(HSCs)P2X7受体的表达水平最低，表达水平随着分化程度的增加而增加。这些结果提示，P2X7受体在细胞不同分化阶段发挥不同的作用。P2X7受体在造血干/祖细胞(HSPCs)中过表达可导致体外集落单位形成能力下降和体内移植潜力下降，表明高水平的P2X7受体介导的嘌呤能信号是HSPCs扩增的负调控因子，且其在从正常HSPCs到造血干细胞白血病前期干细胞或白血病干细胞(LSCs)的克隆进化过程中并无扩增优势。虽然其机制尚不清楚，但通过阻断P2X7受体介导的嘌呤能信号转导可能是促进HSPCs扩增的一种方法[7]。

3.2 P2X7受体参与白血病细胞凋亡 作用于P2X受体或P2Y受体的胞外ATP还可通过不同途径(凋亡、坏死和焦亡)触发癌细胞死亡，这取决于ATP浓度和细胞类型。典型的细胞毒性P2受体为P2X7受体[11]。P2X7受体是一种不寻常的受体，ATP诱导的大量激活导致非选择持续开放的膜孔道的形成，进一步触发细胞死亡信号。最近研究表明，高水平的ATP在一些肿瘤细胞中显示出直接的细胞毒效应。急性髓细胞白血病(AML)细胞表达高水平的P2X7受体，Salvestrini等[15]首次报道白血病干/祖细胞也表达P2X7受体，发现大剂量的ATP激活P2X7受体可有效地诱导LSCs凋亡，但是这种细胞毒作用对正常造血干/祖细胞没有影响，认为ATP活化P2X7受体可在LSC水平诱导AML的治疗反应，并且不会对正常造血干细胞造成影响。这些结果为开发AML新疗法提供了证据。

3.3 P2X7受体基因多态性变化 在人类P2X7受体的表达中，各种P2X7单核苷酸多态性的遗传对功能的丧失或获得以及疾病关联的影响各不相同。具有家族遗传背景的CLL发病率几乎是普通群体的3倍，其中一个诱发因素可能是淋巴细胞凋亡机制遗传失败。为了确定单核苷酸的多态性(SNP)形成的功能丧失型P2X7受体，进而导致促凋亡信号通路的缺陷是否存在于CLL患者的B淋巴细胞，Wiley等[16]研究发现，CLL患者1 513A→C的基因突变率和突变频率均为正常对照组的3倍；通过分析ATP诱导的细胞凋亡，确证了1个或2个P2X7受体不活跃等位基因的存在降低了ATP诱导B淋巴细胞凋亡的敏感性，这可能导致体内B淋巴细胞生存期延长；他们还提出CLL患者中杂合子无功能性P2X7受体等位基因的普遍增加，将使P2X7受体基因成为一个新的肿瘤抑制基因，其中P2X7受体的单倍剂量不足是CLL发病的早期危险因素。外显子13(1 513A/C)是P2X7受体基因的一个常见SNP位点，它可编码功能活跃和无功能的蛋白，1 513A→C可导致P2X7受体功能缺失，但不影响其表达。Nückel等[17]研究发现，慢性淋巴细胞白血病患者与正常对照组的P2X7受体1 513A/C基因频率并无显著差异，与已知的CLL预后因子如CD38的表达、VH基因突变状态和ZAP-70的表达相比，P2X7受体的基因多态性在判断预后中的意义不大。一些基因多态性与P2X7受体活性的增强有关，例如Ala348Thr多态性，与野生型相比，其活性增加了3倍。Koldej等[18]研究发现，具有SNP Gln460Arg的同种异体造血干细胞供者在粒细胞集落刺激因子作用下，能够显著增强CD34+造血干细胞的动员，而功能缺失或获得型P2X7 SNPs与CD34+HSC动员之间没有明显的联系，表明P2X7受体的表达可能通过促进骨髓G-CSF介导的炎症和增强中性粒细胞弹性酶介导的HSC的释放，来影响同种异体供体的HSC动员效率。如果在更大的队列中验证了这个结果，可能会为骨髓捐助增加一个新的筛选标准。冯丽等[19]成功构建野生型及N187D突变型P2X7与Notch1胞内区片段(ICN1)基因的共表达载体，并在白血病细胞中表达，为进一步探讨P2X7受体在白血病发展中的作用奠定了基础。

4 P2X7受体与白血病治疗

白血病治疗多药方案中使用的化疗药物包括甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤(6-MP)和氟达拉滨，它们都以嘌呤代谢为靶向。研究发现，6-MP(500 nmol/L)和苏拉明(200 μmol/L)有相似的抗增殖作用，与未经治疗的对照组相比，Jurkat细胞减少了多达80%。重要的是，苏拉明和6-MP的联合应用增加了单种药物的抗增殖潜力，并且完全阻止了细胞增殖。另外，与6-MP联合苏拉明相比，6-MP与P2X1受体特异性抑制剂NF023或P2X7受体特异性抑制剂A438079的联合应用可引起类似但稍弱的反应。研究还表明，P2X1或P2X7受体抑制剂联合化疗药物6-MP可完全阻断Jurkat细胞的增殖，低毒性剂量的苏拉明或特异性P2X受体抑制剂可与其他化疗药物(如6-MP)联合使用。嘌呤能信号转导机制可能是提高ALL化疗治疗效果的潜在药物靶点。而不同癌细胞系对嘌呤能抑制剂的敏感性不同，可以用之前在这些不同癌细胞系中描述的线粒体功能差异来解释[12]。一些制药和生物技术公司已经开发出针对P2X7受体的小分子抑制剂或抗体，其中一些化合物已被用于治疗某些慢性炎症性疾病的Ⅰ/Ⅱ期临床试验，并已显示出可接受的耐受性和安全性。目前在P2受体中，靶向P2X7和P2Y12受体的癌症治疗具有最佳前景[11]。基质激活的AML细胞抗凋亡信号通路PI3K/AKT/mTOR可减弱白血病细胞对传统化疗的反应，Bian等[20]研究发现，在肿瘤微环境中，胞外ATP可能处于较高水平，肿瘤细胞上P2X7激活后可同时阻断AMPK-PRAS40-mTOR和PI3K/AKT信号通路的传导，诱导细胞自噬和生长抑制，最终可导致肿瘤细胞死亡。因此Salvestrini等[15]假设ATP可以干扰基质诱导的AML细胞的抗凋亡信号，研究发现正常基质和AML来源基质均不影响ATP对白血病细胞的促凋亡作用，提示ATP治疗AML可绕过基质介导的耐药。进一步研究发现，ATP联合阿糖胞苷显著增强了ATP的细胞毒作用，降低了杀死白血病细胞所需的化疗药物浓度。LSCs对现有治疗方法的耐药性以及药物毒性是AML患者治疗失败的主要原因，尤其是老年人。这些数据可能对治疗年老体弱的AML患者具有临床意义，这些患者一般不适合标准剂量的化疗。使用ATP作为常规化疗药物的佐剂可以降低其剂量和毒性，同时保持其治疗效果。Lecciso等[21]研究表明，在柔红霉素化疗死亡的AML细胞中，其释放的ATP可通过P2X7受体诱导DC的活化、成熟和IDO1的表达，而IDO1的上调可诱导免疫抑制性Treg细胞的产生，这将有助于在AML中创造一个免疫抑制的微环境来妨碍机体抗白血病的免疫反应。因此，更好地了解在化疗过程中诱导形成白血病免疫抑制微环境的机制，对充分利用抗白血病药物的免疫潜能，以发挥更好的作用具有重要临床意义。

5 小结与展望

癌症与P2受体关系的相关研究中，P2X7受体似乎最吸引人的兴趣，P2X7受体介导的信号传导复杂，激活P2X7受体可以促进细胞增殖或诱导细胞死亡，这两种相反效应的调控机制目前还不完全清楚。如处于胞外高ATP环境肿瘤细胞如何利用P2X7受体进行生长和扩散，同时又能不受细胞毒性非选择性大孔(LP)的影响而存活下来，关于LP开放的分子机制和功能有待深入研究。另一方面，P2X7受体在免疫反应中发挥重要作用，它可以抑制一些肿瘤的生长，因此抑制P2X7受体后产生的免疫抑制是当前面临的重大问题。因此，使用P2X7受体拮抗剂成功治疗癌症的关键是选择性地靶向癌细胞，同时不损害宿主免疫反应。通过正向调节肿瘤细胞LP的形成来触发细胞死亡或增强免疫反应来促进抗肿瘤反应，可避免免疫抑制。关于P2X7受体参与癌症的多项研究结果似乎相互矛盾，对于其表达、活性和作用的研究结果的争议也最多；随着对P2X7受体在白血病中作用机制的不断深入研究，靶向P2X7受体治疗白血病仍具有广阔的发展前景。