外周血循环肿瘤细胞监测在乳腺癌术后转移早期诊断中的应用

华红，郝贵亮，王清玲，於晶，解童玲，姚鲁璐

(1青岛市海慈医疗集团，山东青岛266033；2青岛市妇女儿童医院)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，我国每年有近7万人死于此疾病[1,2]。研究表明，30%～40%的早期乳腺癌患者会发展为转移性乳腺癌(MBC)，死亡风险极高[3,4]。目前，临床上除了影像学诊断外，血清标志物中使用最普遍的检测指标是糖类抗原15-3(CA15-3)和癌胚抗原(CEA)，但此指标特异性差、灵敏度不高[5,6]。因此，寻找创伤小、灵敏度高的血清分子标志物，对乳腺癌患者术后转移的早期诊断具有重要意义。循环肿瘤细胞(CTC)是利用现代技术，在肿瘤患者血液中检测到的一种微转移细胞。它是实体瘤或转移灶中的肿瘤细胞进入外周血循环，在循环中肿瘤细胞相互聚集形成的微小癌栓，是乳腺癌远处转移复发的重要环节[7]。我们猜测，乳腺癌患者术后血液中出现CTC的时间要早于临床确诊转移的时间。因此，我们对96例乳腺癌患者术前至术后3年内外周血CTC的变化进行了监测，并记录其术后临床转移情况，探讨监测外周血CTC对临床早期发现乳腺癌术后转移的意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选择2012年8月～2014年8月我院收治的乳腺癌患者96例作为乳腺癌组，均为女性，年龄25～73岁、中位年龄46.5岁，右侧54例、左侧42例。经免疫组织化学分型：Luminal A型42例、Luminal B型33例、HER-2过表达型16例、三阴性型乳腺癌5例。纳入标准：患者病理组织切片证实原发性病灶为浸润性乳腺癌；均行乳腺癌改良根治术治疗；术前均行乳腺超声及钼靶检查；术前、术后按本研究随访时间进行CTC监测及全身CT、MRI扫描；发现的转移灶经病理组织学确诊。排除标准：非原发性病灶；非经过改良根治术治疗；有严重的并发症。将同期在我院确诊的乳腺纤维瘤患者30例作为对照组。患者均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会同意批准。

1.2 主要试剂和仪器 CK8/18鼠抗人单克隆抗体(美国CST公司)；人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司)；流式细胞仪(美国Beckman公司)；低温超速离心机(德国Eppendorf公司)。

1.3 外周血CTC监测方法

1.3.1 监测时间 乳腺癌组患者于术前24 h内、术后每隔3个月定期监测外周血CTC，截止时间为术后检测出CTC阳性，如未检测出阳性则随访至术后3年。记录术前24 h内CTC阳性例数及术后检测到CTC阳性的时间。

1.3.2 外周血CTC检测方法

1.3.2.1 标本收集 用真空ACD抗凝管抽取乳腺癌组患者术前24 h内及术后各随访时间(见1.4)获得的肘静脉血10 mL，以及对照组肘静脉血10 mL，立即轻柔充分混匀抗凝管8次，防止血块形成，室温存放，在24 h之内行外周血CTC检测。

1.3.2.2 富集CTC 采用密度梯度离心法。首先准确吸取7.5 mL人淋巴细胞分离液于干净的试管内，取患者7.5 mL全血与等量的Hank′s液混匀，离心后取环状乳白色单个核细胞层，向其中加入5 mL Hank′s液，再次离心后，吸取试管底部细胞沉积，重复一次后吸取试管底部细胞。

1.3.2.3 CTC检测 采用流式细胞术(FCM)。以CK8/18阳性细胞为CTC待测细胞，向其中先加入500 μL预冷(4 ℃)固定液，室温下孵育离心后弃上清加入1.5 mL破膜剂，充分混匀后室温下孵育离心后加入2 mL PBS液，混匀后分成两管，一管为试验管，一管为阴性对照管。将试验管加入CK8/18鼠抗人单克隆抗体5 μL，低速混匀，室温孵育后加入PBS液2 mL，离心后弃去上清液。试验管和对照管分别加入荧光二抗5 mL，低速混匀，5 min后弃去上清液，再加入1%多聚甲醛0.5 mL，低速混匀后放置4 ℃冰箱避光保存，备上机检测。

1.3.2.4 CTC阳性评价标准 以7.5 mL外周血单核细胞中CK8/18阳性细胞数来表示外周血 CTC含量，当外周血CTC≥5个/7.5 mL时判定为阳性。

1.4 术后肿瘤转移情况随访 对乳腺癌组患者于术后的第3个月起随访至术后3年，每隔3个月行全身CT及MRI扫描；如发现外周血CTC呈阳性，则调整为每隔1个月进行全身CT及MRI扫描。发现影像学转移后，经病理组织学检查确诊临床转移，记录术后肿瘤转移例数及部位。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。临床资料的描述采用百分比，频数资料组间的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组CTC检测结果

2.1.1 术前及对照组CTC检测结果 术前患者CTC总阳性率为43.7%(42/96)，其中Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型、三阴性型患者的CTC阳性率分别为33.3%(14/42)、51.5%(17/33)、56.3%(9/16)、40.0%(2/5)；对照组阳性率为0(0/30)。术前患者CTC总阳性率高于对照组(P<0.01)，各病理分型CTC阳性率均高于对照组(P均<0.01)，不同病理分型的乳腺癌患者CTC阳性率差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.1.2 乳腺癌组患者术后CTC监测结果 术后第3个月时，患者外周血CTC均为阴性。随访至3年时，CTC阳性患者为31例。

2.2 术后肿瘤临床转移情况 随访3年期间，经病理组织学确诊发生临床转移42例，其中腋窝淋巴结转移11例、肺胸膜转移13例、颅脑转移6例、肝转移5例、骨转移7例。

2.3 术后发生临床转移患者的CTC阳性率情况 术后3年内，42例发生肿瘤转移患者的外周血CTC总阳性率为73.8%(31/42)，其中腋窝淋巴结转移、肺胸膜转移、颅脑转移、肝脏转移、骨转移患者的CTC阳性率分别为81.8%(9/11)、69.2%(9/13)、66.7%(4/6)、100%(5/5)、57.1%(4/7)。各部位转移患者间的CTC阳性率差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.4 术后出现CTC阳性至临床确诊转移时间的分析 31例CTC阳性患者中，术后出现CTC阳性至临床确诊转移的时间，最短为检测到CTC阳性后第12周、最长为第44周，其中检测到CTC阳性后第12周发现1例、第16周发现6例、第20周发现9例、第24周发现7例、第28周发现4例、第32周发现2例、第36周发现1例、第44周发现1例，在检测到CTC阳性后第16～28周有26例CTC阳性患者发生转移，占83.8%，是临床确诊乳腺癌转移的高峰时段。

3 讨论

乳腺癌是一种高度异质性肿瘤，其基因异质性决定了其复杂的生物学行为和临床病理特点。研究表明，30%～40%的早期乳腺癌患者即使接受了手术治疗，仍会发展为MBC，而MBC患者死亡风险极高，治疗以缓解临床症状、改善生活质量及提高生存率为主。因此，越早发现乳腺癌术后转移，可以更及时有效地选择合适的治疗方案，大大提高患者的生活质量及存活率。但是，目前MBC常用的血清学标志物灵敏性和特异性均较低，不能满足临床需求。

CTC是利用现代免疫学和分子分析技术，在患者血液中能检测到的一种微转移细胞，它是实体瘤或转移灶中的肿瘤细胞进入外周血循环，在循环中肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成的微小癌栓，是乳腺癌远处转移复发的重要环节。与淋巴骨髓相比，外周血标本具有易获得、创伤小且可以反复采集，患者依从性较强，是临床上常规检测CTC较为理想的标本来源。随着现代化检测技术检测设备的不断发展进步，CTC检测方法的敏感性和特异性将不断提高。本研究发现，术前患者CTC总阳性率高于对照组，表明乳腺癌患者术前外周血CTC阳性明显增高。

作为一种全身性疾病，在早期就有肿瘤细胞扩散到全身[8]。尽管早期根治性手术和手术后放化疗已大大提高了乳腺癌患者的生存期，但仍有大部分患者死于乳腺癌的远处转移。1989年，Ashworth等[9]发现癌症患者血液中存在CTC，认为在乳腺癌早期即有CTC进入血液循环并发生全身播散[10,11]。CTC的出现是肿瘤患者不良结果的一个独立预示指标[12,13]。2007版美国临床肿瘤学会乳腺癌生物学标记物临床应用指南就将CTC列为新的肿瘤标志物[14]。Budd等[15]比较了CTC与传统影像学检测评估治疗结果的预测价值，发现影像学缓解且持续高水平者与影像学缓解且CTC低水平者相比，中位总生存期(OS)显著降低，而影像学进展且CTC低水平者其OS明显比影像学进展且CTC高水平者长，认为外周血CTC含量的变化对于MBC的诊断和预后评估较影像学检测更敏感。因此，动态监测CTC变化，有利于及时了解患者病情，并且可为其制定个体化综合治疗方案提供依据。本研究发现，术后第3个月时，患者血清中CTC均为阴性，CT及MRI均未发现转移灶；之后则检测出CTC阳性患者31例，确诊临床转移患者42例，分析从术后检测到CTC阳性到临床病理组织学确诊的时间，最短为检测到CTC阳性后第12周、最长为第44周，表明外周血CTC比影像学检查至少可以提前12周预测到乳腺癌转移；其中检测到CTC阳性后的第16～28周，83.8%的患者被确诊发生临床转移，表明术后检测到CTC阳性后的第16～28周是临床确诊乳腺癌转移的高峰时段。

综上所述，乳腺癌患者具有较高的外周血CTC阳性率，行改良型根治术后CTC的再次出现是远处转移病灶形成的表现；乳腺癌外周血CTC检测阳性时间明显早于临床确诊时间，可以更早地预测MBC发生，对患者的诊治和评价预后具有重要的临床意义。因此乳腺癌患者外周血CTC监测在乳腺癌患者术后转移的预测方面有着良好的应用前景。