ENPP2对血管内皮细胞增殖和迁移的影响及机制

白玉婷,苏晓灵，刘彦民，年蔚，李卫，魏晓娟，常荣

(1青海省人民医院，西宁 810001；2深圳市龙华区中心医院·广东医科大学附属龙华中心医院)

血管内皮细胞(HUVEC)分布于整个循环系统中，将血管壁与循环血液分离，在几乎所有的基本血管功能中发挥重要作用[1]。血管内皮不仅提供了一种非黏附性、高选择性的物理屏障来控制血管通透性，还释放出大量的血管活性物质来调节血管收缩和血管壁的重塑[2]。研究表明，血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化和心血管疾病的早期特征[3],保护血管内皮功能可预防心血管疾病的发生[4]。溶血磷脂酸(LPA)是一种具有广泛生物活性的溶血磷脂，可引起调节细胞的增殖、迁移、存活等的多种生长因子样反应[5]。焦磷酸酶/磷酸二酯酶2(ENPP2)是分泌LPA的一种重要的酶。有研究表明ENPP2/LPA轴参与血管生成、炎症反应、神经发育等多种病理生理过程[6,7]。2018年8月，我们以HUVEC为研究对象，进一步研究ENPP2/LPA轴对HUVEC增殖和迁移的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 HUVEC、过表达腺病毒Ad.ENPP2和对照病毒受赠予军事科学院医学研究院放射与辐射医学研究所实验血液学实验室。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。RPMI1640细胞培养基购自美国Gibico公司。兔抗人AKT抗体、兔抗人磷酸化AKT(p-AKT)抗体、GAPDH抗体均购自美国Cell Signaling Technology。兔抗人ENPP2抗体购自美国Abcam公司。ECL发光液购自北京庄盟生物科技有限公司。HRP标记的山羊抗兔抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。SBYR荧光定量PCR试剂盒、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。TaqMan Gene Expression Master Mix购自美国ABI公司。TRIzol Reagent美国 Invitrogen公司。BCA蛋白定量检测试剂盒购自美国Thermo公司。蛋白Marker购自中国Genstar公司。Transwell小室购自美国Corning公司。4%多聚甲醛、RIPA购自北京Solarbio公司。CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司。LPA检测试剂盒购自上海古朵生物科技有限公司。结晶紫购自美国Cyagen公司。

1.2 过表达腺病毒Ad.ENPP2感染HUVEC细胞 HUVEC细胞计数后制成2×105/mL的细胞悬液，以1 mL/孔铺入6孔板中过夜，次日更换培养基后随机分为Ad.ENPP2组、Ad.Null组，分别感染腺病毒Ad.ENPP2、Ad.Null，感染剂量为20 MOI，6～8 h后根据细胞状态给予补液，37 ℃ 5% CO2培养箱培养24 h，通过qRT-PCR法、Western blotting法检测感染效率较高。

1.3 HUVEC细胞LPA受体、ENPP2表达检测 采用qRT-PCR法。分别收集HUVEC细胞和感染了腺病毒Ad.ENPP2、Ad.Null的HUVEC细胞3×105/mL，弃去培养基，用PBS清洗1或2次，加入1 mL TRIzol，室温静置5 min，取上清至1.5 mL EP管，加入氯仿200 μL，振荡15 s，室温静置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上层无色水相至新的EP管，加入异丙醇500 μL，轻轻混匀液体，室温静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清，EP管中加入75%乙醇1 mL，轻微洗涤沉淀，4 ℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清，真空干燥10 min，加入20 μL灭菌水溶解沉淀，分光光度计检测RNA浓度。

逆转录反应体系：5 qRT Mix 4 μL，总RNA 2 μg，水补足至20 μL。反应条件：以上液体混匀后短暂离心，25 ℃、10 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min，4 ℃。qRT-PCR反应体系：水3.3 μL，2SYBR PreMix 5 μL，Primer 1 μL，cDNA 0.5 μL，ROX Ⅱ 0.2 μL。将以上混合液加入96孔板中，每个样品3个副孔，瞬时离心后上机，PCR扩增程序：95 ℃ 30 s(预变性)；95 ℃ 5 s、6 ℃ 30 s，40个循环(PCR阶段)。

1.4 ENPP2与LPAR1拮抗剂Ki16198干预HUVEC细胞后磷酸化AKT检测 采用Western blotting法。Ad.ENPP2组、Ad.Null组分别收集感染了腺病毒Ad.ENPP2、Ad.Null的HUVEC细胞3×105/mL，加入细胞裂解液(RIPA 60～100 μL)，充分裂解细胞，加入1% PMSF，-80 ℃反复冻融(39 ℃)细胞3次后4 ℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，取10～20 μL蛋白进行电泳，然后电转至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加GAPDH抗体、ENPP2抗体、AKT抗体、p-AKT抗体，室温慢摇1 h或4 ℃过夜。TBST漂洗3次，每次10 min，加入含有HRP标记的二抗TBST 5 mL(1∶5 000)，室温孵育45 min～1 h，TBST漂洗3次，每次10 min, ECL发光液1∶1配好后曝光，使用Image J软件进行吸光度分析。Ad.ENPP2组、Ad.Null组加入LPAR1拮抗剂Ki16198干预HUVEC细胞，再次检测AKT水平。1.5 细胞增殖检测 采用CCK-8法。Ad.ENPP2组、Ad.Null组HUVEC细胞感染上述病毒后若效率超过85%，用胰酶消化细胞后计数，制成5×103/mL的细胞悬液，以100 μL/孔铺入96孔板中，分别在24、48、72 h后每孔加入CCK-8 10 μL，避光孵育2 h后使用全波长酶标仪读取450 nm波长处光密度(OD)值以检测ENPP2对H9c2细胞增殖的影响。为研究ENPP2调控HUVEC细胞增殖的可能机制，予HUVEC细胞LPAR1拮抗剂Ki16198后再次检测HUVEC细胞增殖情况。

1.6 细胞迁移检测 采用 Transwell实验。HUVEC细胞计数后制成2×104/mL的细胞悬液加至Transwell chamber上室中，用无血清的RPMI1640培养液补足至200 μL，下室加入含10%FBS的RPMI1640 800 μL，37 ℃ 5% CO2培养箱培养10 h。取出chamber，用移液抢吸干上室液体，PBS 800 μL清洗3次，4%多聚甲醛800 μL固定30 min。吸干上室多聚甲醛，800 μL PBS清洗3次，结晶紫800 μL染色20～30 min，吸干上室结晶紫，800 μL PBS清洗3次，湿棉签轻轻擦拭上室，显微镜取9个视野拍照后计数。为研究ENPP2调控HUVEC细胞迁移的可能机制，予HUVEC细胞LPAR1拮抗剂Ki16198后再次检测HUVEC细胞迁移情况。

1.7 LPA水平检测 HUVEC细胞感染Ad.ENPP2、Ad.Null病毒后取细胞培养上清，按LPA检测试剂盒说明书加入检测液，用全波长酶标仪于450 nm波长处测量OD值。根据标准品的浓度及测得的OD值计算标准曲线的直线回归方程，根据测得的样品OD值在直线回归方程上计算相应浓度。

2 结果

2.1 HUVEC细胞中LPA受体表达 HUVEC细胞中LPAR1～LPAR6的相对表达量分别为0.377±0.011、0.004±0.002、0.002±0.001、0.000±0.000、0.000±0.000、0.007±0.001，HUVEC细胞中LPAR1表达最高，其次为LPAR6、LPAR2、LPAR3、LPAR5、LPAR4。

2.2 HUVEC细胞感染腺病毒后ENPP2表达 Ad.ENPP2组、Ad.Null组ENPP2 mRNA相对表达量分别为0.186±0.004、0.002±0.000，ENPP2蛋白相对表达量分别为1.261±0.080、0.532±0.031，两组HUVEC细胞中的ENPP2 mRNA、蛋白相对表达量比较，P均<0.05。

2.3 ENPP2、Ki16198对HUVEC细胞AKT信号通路的影响 HUVEC细胞过表达ENPP2后，Ad.ENPP2组、Ad.Null组AKT相对表达量分别为0.539±0.008、0.107±0.004，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。HUVEC细胞给予Ki16198后，Ad.ENPP2组、Ad.Null组AKT相对表达量分别为0.882±0.062、1.154±0.074，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 过表达ENPP2对HUVEC细胞增殖的影响 Ad.ENPP2组在24、48、72 h时HUVEC细胞的增殖倍数分别为2.355±0.018、4.365±0.096、4.980±0.111，Ad.Null组分别为1.983±0.050、4.017±0.077、4.728±0.059。与Ad.Null组相比，Ad.ENPP2组过表达ENPP2后HUVEC细胞于24、48和72 h增殖倍数增加(P均<0.05)。

2.5 过表达ENPP2对HUVEC细胞迁移的影响 Ad.ENPP2组、Ad.Null组细胞迁移个数分别为(569.333±70.465)、(401.000±62.610)个/HP,与Ad.Null组相比，Ad.ENPP2组HUVEC细胞迁移能力增加(P<0.05)。

2.6 LPAR1拮抗剂Ki16198对HUVEC细胞增殖的影响 HUVEC细胞给予Ki16198后，Ad.ENPP2组在24、48、72 h时HUVEC细胞的增殖倍数分别为2.416±0.010、4.351±0.233、4.994±0.208，Ad.Null组分别为2.355±0.018、4.219±0.116、4.980±0.111，两组24、48、72 h时HUVEC细胞的增殖倍数比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.7 LPAR1拮抗剂Ki16198对HUVEC细胞迁移的影响 HUVEC细胞给予Ki16198后，Ad.ENPP2组细胞迁移个数分别为(314.333±21.733)、(423.667±27.683)个/HP，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.8 过表达ENPP2对HUVEC细胞培养上清中LPA水平的影响 Ad.ENPP2组、Ad.Null组细胞培养上清中LPA水平分别为(612.267±69.940)、(476.184±15.995)nmoL/L，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

新生血管是局部组织再生及修复的最主要因素，血管内皮细胞的增殖、分化、迁移以及汇聚是组织新生血管化的重要步骤，而其功能的障碍贯穿冠状动脉粥样硬化性心脏病及心血管事件的整个过程[8]。内皮功能障碍是动脉粥样硬化的一个重要特征，包括细胞增殖缺陷和异常凋亡，其中内皮细胞的增殖能力通过修复血管内皮来应对损伤是维持内皮细胞壁完整性所必需的[9]。

ENPP2是维持LPA水平的主要酶ENPP2/LPA信号通路的异常与心血管疾病密切相关。为研究ENPP2/LPA轴在HUVEC细胞中的调控作用，我们首先研究了ENPP2对HUVEC细胞增殖和迁移的影响。结果显示，过表达ENPP2可以促进HUVEC细胞的增殖和迁移。提示ENPP2在新生血管化中发挥重要作用。

LPA是一种小的、普遍存在的磷脂，通过结合并激活G蛋白偶联受体(LPAR1～6)而发挥细胞外信号分子作用，具有神经发生、血管生成、促进细胞迁移、存活及致癌作用[10]。其中LPAR1、LPAR3～5广泛分布于心血管组织中。Shlyonsky等[11]研究显示，在慢性低氧诱导的肺动脉高压模型中，大鼠肺组织和血清中LPA水平明显升高，低氧组动物的血清对大鼠原发性肺成纤维细胞具有明显的趋化作用，LPAR1和LPAR3的拮抗剂可阻止细胞迁移，LPA可以促进血管生成，有助于肺血管的重塑。为了进一步研究ENPP2促进HUVEC细胞增殖和迁移的可能作用机制，我们检测了HUVEC细胞中LPA受体表达及细胞培养上清中LPA浓度。结果显示，HUVEC细胞可表达LPAR1～6，主要表达LPAR1、LPAR6、LPAR2。进一步研究，结果显示，过表达ENPP2可以促进HUVEC细胞LPA浓度的升高，提示ENPP2可能通过促进LPA产生并与LPA受体结合进一步促进HUVEC细胞的增殖和迁移。LPAR1主要通过活化MAPK、PI3K/AKT、Rho等途径发挥作用，介导细胞的增殖、存活和迁移[13]。另外，有研究表明，ENPP2/LPA轴可通过调控AKT信号通路促进H9c2细胞的增殖和迁移[14]。Hwang等[14]认为，LPA通过激活LPA1/3受体，刺激血管内皮细胞增殖、迁移、丝裂原活化蛋白激酶磷酸化、Rho和Ca2+活化，发挥血管生成效应。本研究结果显示，过表达ENPP2可以上调HUVEC细胞p-AKT活性，提示AKT信号通路参与ENPP2调控的HUVEC细胞的增殖和迁移。Ki16198是LPA受体拮抗剂，可同时拮抗LPAR1和LPAR3，本研究发现，与对照组相比，Ki16198对HUVEC细胞的增殖没有影响，但能抑制HUVEC细胞的迁移，与此同时，我们检测了HUVEC细胞给予Ki16198后AKT信号通路表达的情况，结果显示，Ki16198可以下调HUVEC细胞p-AKT表达，提示Ki16198可能通过拮抗LPAR1进而调控AKT信号通路影响HUVEC细胞的迁移。

综上所述，ENPP2/LPA轴可能通过调节AKT信号通路调控HUVEC细胞的增殖和迁移，LPA受体拮抗剂Ki16198可能通过抑制LPAR1进而抑制AKT信号通路而调控HUVEC细胞的迁移。