二甲双胍对胃癌细胞糖代谢及其相关蛋白HIF-1α、PKM2表达的影响

姚萍，陈玲

(1徐州医科大学附属市立医院，江苏徐州 221004;2中国人民解放军陆军第七十一集团军医院)

胃癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，据报道，胃癌患者的病死率仅次于肺癌[1]。肿瘤细胞进行能量代谢所必需的底物是葡萄糖，且其对葡萄糖的摄取能力是普通细胞的10倍，糖酵解能力是普通细胞的20～30倍[2]。关于胃癌等癌细胞糖代谢相关内容是肿瘤代谢领域研究的热点，糖代谢异常作为一种病理生理状态在胃癌的发生发展过程中贯穿始终[3,4]。二甲双胍是临床常用的口服降糖药，近年研究发现，其降糖的同时还具有抑制肿瘤的作用，可降低糖尿病患者肿瘤发病率，因而得到广泛关注[5]。有研究表明，二甲双胍可通过影响肿瘤细胞葡萄糖转运和糖酵解过程，进而抑制肿瘤细胞的生长和增殖[6]。M2型丙酮酸激酶(PKM2)是细胞糖酵解通路中的关键限速酶。在细胞缺氧时，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)被激活，进而激活下游的糖酵解酶基因转录。研究表明，HIF-1α与PKM2存在密切联系，可相互促进表达[7]。2018年5月，我们以不同浓度二甲双胍干预胃癌MGC-803细胞，检测糖代谢相关蛋白HIF-1α、PKM2表达，探讨二甲双胍对胃癌糖代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI1640培养基(美国Gibco公司)；FBS(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶1∶250(美国Gibco公司)；青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司)；乳酸检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；葡萄糖检测分析试剂盒(上海金畔生物科技有限公司)；通用型蛋白酶抑制剂(上海威奥生物科技有限公司)；蛋白抽提试剂(德国MERCK)；ECL发光液(德国Merck Millipore公司)；RT-PCR试剂盒(美国 Thermo Scientific 公司)；SYBR Green荧光实时定量PCR试剂盒(罗氏生物科技公司)；TRIzol总RNA提取试剂(日本TAKA-RA公司)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；HIF-1α兔抗人单克隆抗体(美国Abcom公司)；PKM2兔抗人单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)。兔抗人GAPDH单克隆抗体(美国 Bioworld 公司)；通用型二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；恒温细胞培养箱(美国赛默飞公司)；450型全波长酶标仪(美国百特公司)；恒压电源、电转槽、电泳槽、Bio-Rad成像系统、实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。二甲双胍购自中国食品药品检定研究院；MGC-803细胞株购自上海中国科学院细胞所。

1.2 细胞培养及分组 将MGC-803细胞均匀接种于含有10%FBS、100 U/mL青、链霉素的RPMI1640培养基中，于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。镜下观察，细胞贴壁生长至对数生长期后，用0.25%胰蛋白酶消化液消化2 min，加含10%FBS的RPMI1640培养基终止消化。转移至离心管中，1 000 r/min，离心2 min，弃上清，再加入新的10%FBS的RPMI1640培养基将细胞吹打均匀，分瓶种于新的培养瓶中继续培养，一般2～3 d进行1次传代。传代后的细胞根据培养体系不同分为阴性对照组和二甲双胍低、中、高剂量组，于温箱培养24 h，吸出培养基，每组细胞均换成不含FBS的 RPMI1640培养液同步培养24 h。

1.3 葡萄糖摄取量检测 细胞贴壁并且同步培养后，二甲双胍低、中、高剂量组分别加入含1、5、10 mmol /L二甲双胍的培养基，阴性对照组培养基不变，细胞培养24 h后，收集培养基上清液，并设置空白对照组(即新的空白培养基)，按照葡萄糖检测分析试剂盒说明书进行操作。根据葡萄糖标准品绘制的标准曲线，计算出各组培养基上清液中葡萄糖含量，各组细胞的葡萄糖摄取量=空白对照组葡萄糖含量-各组培养基中葡萄糖含量。

1.4 乳酸生成量检测 同1.3中操作步骤，MGC-803细胞经二甲双胍处理24 h后，收集培养基上清，按照乳酸检测试剂盒说明书进行操作。应用450型自动酶标仪在530 nm波长处测定并记录样品吸光度。乳酸生成量计算公式：乳酸生成量(mmol/L)=3×(样品-空白对照)/(标准品-空白对照)。

1.5 HIF-1α、PKM2蛋白表达检测 采用Western blotting法。各组细胞经二甲双胍(0、1、5、10 mmol/L)处理24 h后，弃去培养基，并用预冷的PBS冲洗3次，用胰蛋白酶将细胞消化下来并用RPMI1640培养基终止，转移至离心管中，离心弃上清，再用预冷的PBS冲洗3次，离心弃上清，各组加入蛋白裂解液于冰上裂解30 min，每隔5 min摇晃1次，离心留取上清，BCA法测定蛋白浓度，煮水浴8 min进行蛋白变性处理。蛋白上样量为40 μg，70 V电泳至浓缩胶与分离胶边界时(约30 min)，调为110 V继续电泳1 h，60 V恒压转膜2 h，5% BSA室温封闭2 h，GAPDH一抗(1∶1 000)，HIF-1α一抗(1∶500)，PKM一抗(1∶1 000)，于4 ℃冰箱中孵育过夜，TBST洗，二抗(1∶2 000)室温摇床孵育1 h，化学发光、显影，通过Image J软件统计灰度值，计算HIF-1α、PKM2蛋白相对表达量。

1.6 HIF-1α、PKM2 mRNA表达检测 采用Real-time PCR法。各组细胞经二甲双胍(0、1、5、10 mmol/L)处理24 h后，弃去培养基，并用预冷的PBS冲洗3次，使用TRIzol试剂提取各组细胞的总RNA，并测量各组RNA浓度，取1 μg RNA逆转录成cDNA，根据Real-time PCR反应体系取5 μL cDNA作为模板，扩增条件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，循环扩增38次，每份样本的基因拷贝数用Ct 值表示，采用2-ΔΔCt法分析基因相对表达量。HIF-1α正向引物：5′-TGCAACATGGAAGGTATTGC-3′，反向引物：5′-TTCAAATCAGCACCAAGC-3′，扩增产物长度118 bp。PKM2正向引物：5′-AGAACATCCTGTGGCTGGAC-3′，反向引物：5′-ACCTTTCTGCTTCACCTGGA-3′，扩增产物长度107 bp。GAPDH正向引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反向引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，扩增产物长度98 bp。

2 结果

2.1 二甲双胍对MGC-803细胞葡萄糖摄取量的影响 阴性对照组和二甲双胍低、中、高剂量组葡萄糖摄取量分别为(1 962±60.23)、(1 633±72.65)、(1 415±83.25)、(1 230±65.94)μmol/L，与阴性对照组比较，二甲双胍低、中、高剂量组葡萄糖摄取量均不同程度下降(P均<0.05)；与低剂量组比较，中、高剂量组葡萄糖摄取量下降(P均<0.05)。

2.2 二甲双胍对MGC-803细胞乳酸生成量的影响 阴性对照组和二甲双胍低、中、高剂量组乳酸生成量分别为(5.00±0.321)、(4.22±0.210)、(3.30±0.154)、(2.73±0.170)mmol/L，与阴性对照组比较，二甲双胍低、中、高剂量组乳酸生成量均有所下降(P均<0.05)；与低剂量组比较，中、高剂量组乳酸生成量均下降(P均<0.05)。

2.3 二甲双胍对MGC-803细胞HIF-1α、PKM2蛋白表达的影响 阴性对照组和二甲双胍低、中、高剂量组HIF-1α蛋白相对表达量分别为0.721±0.031、0.564±0.052、0.509±0.061、0.420±0.024，与阴性对照组比较，二甲双胍低、中、高剂量组HIF-1α蛋白表达降低(P均<0.01)，与二甲双胍低剂量组比较，二甲双胍高剂量组HIF-1α蛋白表达降低(P<0.05)。阴性对照组和二甲双胍低、中、高剂量组PKM2蛋白相对表达量分别为0.684±0.071、0.441±0.063、0.391±0.050、0.307±0.042，与阴性对照组比较，二甲双胍低、中、高剂量组PKM2蛋白表达降低(P均<0.01)，与二甲双胍低剂量组比较，二甲双胍高剂量组PKM2蛋白表达降低(P<0.05)。

2.4 二甲双胍对MGC-803细胞HIF-1α、PKM2 mRNA表达的影响 阴性对照组和二甲双胍低、中、高剂量组HIF-1α mRNA相对表达量分别为1.000±0.000、0.787±0.036、0.648±0.021、0.604±0.034，PKM2 mRNA相对表达量分别为1.000±0.000、0.716±0.023、0.621±0.040、0.498±0.032，与阴性对照组比较，二甲双胍低、中、高剂量组HIF-1α、PKM2 mRNA表达降低(P均<0.01)；与二甲双胍低剂量组比较，二甲双胍高剂量组HIF-1α、PKM2 mRNA表达降低(P均<0.05)。

3 讨论

胃癌细胞进行活跃的能量代谢，并将葡萄糖作为主要的ATP来源[8]。临床多数胃癌患者处于围手术期时，受到外界因素的刺激而长期处于一种应激状态，癌细胞便会启动DNA损伤修复等一系列自我防御机制来适应，该过程需消耗大量的ATP进行能量代谢。肿瘤细胞能量代谢的主要方式是高水平的糖酵解，由于肿瘤具有快速增殖的特点，使其常处于缺氧环境中，而糖酵解活动则可使肿瘤细胞即使在缺氧条件下，仍可正常生长。糖代谢异常是肿瘤细胞的一个重要特征，亦是肿瘤快速增殖、生长的关键特征，正如德国生物化学家瓦博格提出的瓦博格效应一样[9]，肿瘤细胞通过糖酵解快速获得能量。

丙酮酸激酶(PKM)有两种亚型，即PKM1、PKM2，其中PKM2在肿瘤细胞糖酵解及细胞增殖过程中发挥重要作用。PKM2以一种低活性的二聚体形式存在于肿瘤细胞中，是糖酵解的最后一个限速酶，在肿瘤细胞中高表达[10]，而肿瘤中PKM2高表达与其TNM分期及预后密切相关[11]。HIFs属于一种核转录因子，包括HIF-1α和HIF-2α，是参与缺氧调节最重要的两种缺氧诱导因子，当肿瘤细胞缺氧时，转录并激活多种下游因子，使其耐受缺氧状态[12]。活化的HIF-1α在糖代谢途径发挥主导功能，并调控多种靶基因的转录，而关于HIF-2α在这方面的作用研究甚少，PKM2充当HIF-1α的辅助转录因子，在肿瘤细胞核中与HIF-1α相互作用，影响肿瘤细胞的能量代谢及增殖、凋亡产生[13]。

二甲双胍可通过降低肿瘤细胞耗氧量，抑制HIF-1α的聚集[14]，并抑制HIF-1α的合成，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长。在对咽癌、甲状腺癌等肿瘤细胞的研究中发现，二甲双胍可有效抑制肿瘤细胞的增殖、促进其凋亡[15]。本研究发现，用不同浓度的二甲双胍处理MGC-803细胞后，其葡萄糖摄取量及乳酸生成量均下降，说明二甲双胍减弱了其糖代谢活动，且二甲双胍浓度越高，作用越显著，二甲双胍可明显抑制MGC-803细胞中HIF-1α、PKM2表达，有效抑制胃癌细胞的能量代谢，其机制可能与抑制HIF-1α、PKM2基因及蛋白表达有关。

综上所述，二甲双胍可抑制胃癌细胞糖代谢，影响癌细胞生长的能量供应，抑制糖代谢相关蛋白HIF-1α、PKM2表达。