Twist对结直肠癌HCT116细胞上皮-间质转化、肿瘤干细胞表型转化、化疗抵抗的影响

邓君健，张帆，包文婷，熊琳，刘远识，范黎，徐细明

(武汉大学人民医院，武汉430060)

结直肠癌(CRC)是临床常见的肿瘤之一，其发病率居世界第三，而病死率居世界第四[1～4]。随着年龄增大，CRC的发病危险系数逐渐升高，全世界每年约有120万新发病例，同时每年约有60万患者死于CRC。约20%的CRC患者有远处转移，转移的脏器往往是肝脏。上皮-间充质转化(EMT)是癌细胞远处转移的始动因素及基础环节，EMT发生时，肿瘤细胞中的部分胚胎基因重编程，该过程可逆[5～8]。EMT的标志是上皮细胞间连接的溶解及细胞骨架的整体重组，从而导致上皮特征的丧失和间充质形态的获得，这一变化由基因差异表达决定[9，10]。当前CRC的治疗主要是手术切除及放化疗，但伴随放化疗抵抗问题。肿瘤细胞EMT发生时，众多EMT相关转录因子如ZEB1、ZEB2、TWIST、SNAIL的蛋白表达或活性急剧变化，调控下游系列基因簇的表达，与患者的预后相关[11]。EMT在增强细胞侵袭能力的同时，其相关的转录因子如SNAIL，还可促使癌细胞获得肿瘤干细胞的特性，从而获得放化疗抵抗能力[12,13]。扭曲因子Twist是一种具有碱性螺旋-环-螺旋结构域的转录因子，可通过上调胚胎基因表达，介导胚胎的发育[14]。既往研究证实，Twist可促使肿瘤细胞部分基因簇重编程，从而调控肿瘤细胞的EMT行为[15]，然而其在结直肠癌细胞中的更多作用，目前尚不清楚。我们前期研究发现，Twist在结直肠癌组织中的表达高于癌旁组织。2014年2月～2018年5月，我们以结直肠癌细胞系HCT116为研究对象，分析Twist对结直肠癌细胞EMT及干细胞表型、化疗抵抗的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 E-cadherin一抗购自美国Cell Signaling Technology公司，N-cadherin一抗、vimentin一抗、Twist一抗、P-gp一抗、α-tubulin一抗购自美国Santa Cruz Biotechnol公司。Bmi-1一抗、Nanog一抗购自美国Epitomics公司。Alexa Fluor 488/594标记的二抗、辣根过氧化物酶标记的二抗、DAPI染液及Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。PrimeScript一步法逆转录试剂盒RT及荧光定量PCR SYBR染液购自日本TAKARA公司。

1.2 细胞培养、转染及分组 研究所用的人结直肠癌HCT116细胞购自上海中科院细胞典藏中心，培养条件：37 ℃、5%CO2，培养基为McCoy′5a，10%胎牛血清，抗生素。本研究所有细胞实验分为两组：空载体组及Twist过表达组(Twist组)。转染前，将细胞HCT116种至6孔板中，次日将10%的培养基换为无血清培养基，2 h后，空载体组及Twist过表达组分别将2 μg的空载体pcDNA3.1或pcDNA3.1-Twist载体(采用脂质体2000包裹转染)，转染至HCT116细胞。并在转染6 h后，将培养基换为含10%胎牛血清不含抗生素的培养基，继续培养48 h后收取细胞。

1.3 扭曲基因Twis对HCT116细胞的侵袭能力的影响检测 采用博伊登小室进行分析，预先包被基质胶于小室内，随后种植细胞，细胞体积和数量分别为300 μL、1×105个细胞，小室上下培养基不同，上层为1%胎牛血清，此层进行pcDNA3.1或pcDNA3.1-Twist载体转染，下层为10%胎牛血清，此层培养基作为趋化剂，诱导细胞侵袭。细胞培养48 h后，终止培养。以棉花拭子去除包被的基质胶，加入PBS洗涤，随后以浓度为4%的多聚甲醛固定30 min，加入结晶紫染色，拍照分析。每组实验均重复3次。

1.4 Twis对HCT116细胞EMT影响检测 ①Western blotting法。培养的细胞以预冷的PBS洗涤3次，于冰上加入碧云天公司弱型RIPA裂解液进行细胞裂解，反复吹打至细胞脱落，将细胞悬液转移EP管中，随后冰上超声破碎细胞，继续裂解30 min。将样品于4 ℃低温离心机中，12 000 r/min离心15 min，随后吸取上清，测定空载体组及Twist组蛋白浓度，加入Loading buffer 100 ℃煮至蛋白变性，迅速降温，置于-80 ℃冰箱低温保存，直至使用。蛋白表达差异检测，采用Bio-rad公司的蛋白电泳系统，程序如下：SDS-PAGE胶蛋白电泳完毕后，将蛋白电转至 PVDF膜，再以浓度为5%的脱脂牛奶在室温下封闭2 h。以TBST洗涤PVDF膜后，加入E-钙黏蛋白，波形蛋白vimentin一抗工作液过夜(浓度为1∶1 000)。次日，于室温下复温1 h，再次以TBST洗脱，加入辣根过氧化物酶标记的二抗工作液进行孵育(浓度为1∶10 000)，再依次洗涤，曝光，拍照并分析。②免疫荧光法。培养的细胞以预冷的PBS洗涤3次，加入4%多聚甲醛固定10 min，0.1%的Triton100打孔20 min。随后加入E-钙黏蛋白，波形蛋白vimentin一抗工作液过夜(浓度为1∶100)，4 ℃孵育过夜，次日加入荧光二抗工作液(1∶500)，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤后拍照分析。

1.5 肿瘤干细胞标志物蛋白表达检测 细胞转染48 h后，通过光镜观测细胞形态变化，采用Western blotting法检测两组肿瘤干细胞标志物Bmi-1、Nanog、CD44表达。

1.6 细胞活力检测 将细胞种植于96孔板中，细胞密度为1×104，空载体组与Twist组分别进行空载体pcDNA3.1或Twist载体转染，细胞转染48 h后分别加入抗肿瘤药物奥沙利铂刺激，奥沙利铂设置0～10 μmol/L的梯度浓度。测试之前，以PBS洗涤细胞，随后加入MTT试剂，37 ℃孵育4 h，随后去除孵育试剂，置换为DMSO溶液，于570 nm波长处测定细胞活力。

1.7 P-gp蛋白表达检测 HCT116细胞转染pcDNA3.1、Twist过表达质粒48 h后，采用 Western blotting法检测P-gp蛋白表达。

1.8 化疗抵抗相关分子ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCG2、ERCC1、XRCC1、MSH2、TUBB3、POLH、GSTπ、γ-GT1蛋白表达检测 采用酚氯仿法萃取提取化疗抵抗相关分子RNA。向细胞培养板中加入TRIzol，反复吹打，吸取至EP管，室温静置10 min后，加入氯仿萃取，TRIzol∶氯仿=5∶1。再次室温静置15 min，4 ℃低温下，12 000 r/min离心15 min，随后小心吸出上层水相，加入等体积的异丙醇沉淀RNA，混匀后4 ℃低温过夜。次日4 ℃低温下，12 000 r/min离心10 min，获得RNA，再依次以75%、95%乙醇洗涤RNA沉淀，随后加入DEPC水溶解RNA。采用日本TAKARA公司的一步法逆转录cDNA合成试剂盒合成cDNA。每次反应采用的RNA为1 μg、20 μL体系。PCR反应程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，降温至4 ℃。待反应完成，立即将样本取出，并置于-80 ℃冰箱保存。采用TAKARA公司的荧光定量PCR Mix Buffer进行定量扩增反应，反应体系为20 μL，反应程序：95 ℃预变性5 min，随后进行39个循环扩增，包括95 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，最后5 min溶解曲线。PCR结果采用GAPDH校正，以校正值为统计值。

2 结果

2.1 两组细胞侵袭能力比较 Twist组HCT116细胞的形态由圆形向长梭形态分化，空载体组与Twist组HCT116细胞穿膜细胞数分别为(6.24±0.89)、(26.83±1.02)个/HP,两组比较，P<0.05。

2.2 两组E-钙黏蛋白、波形蛋白表达比较 空载体组与Twist组EMT相关分子蛋白E-钙黏蛋白相对表达量分别为0.82±0.09、0.24±0.04，波形蛋白相对表达量分别为0.12±0.02、1.05±0.12，两组E-钙黏蛋白、波形蛋白表达比较，P均<0.05。

2.3 两组细胞向肿瘤干细胞表型转化情况比较 过表达Twist可显著上调HCT116细胞成球能力，空载体组与Twist组HCT116细胞成球数量分别为(2.43±0.14)、(10.19±0.58)个/HP，两组比较，P<0.05。荧光定量PCR及Western blotting检测结果显示，Twist可促进肿瘤干细胞标志物Bmi-1、Nanog、CD44表达，空载体组与Twist组干细胞相关分子Nanog相对表达量分别为0.06±0.01、0.88±0.07，Bmi1相对表达量分别为0.23±0.04、1.26±0.88，CD44相对表达量分别为1.45±0.09、8.92±0.89，两组Nanog、Bmi1、CD44表达比较，P均<0.05。

2.4 两组细胞对化疗药物的抵抗能力及P-gp蛋白表达比较 上调Twist可显著抑制化疗药物奥沙利铂对HCT116细胞的杀伤作用，在高浓度药物情况下，产生明显抵抗。Twist可显著上调ABCB1的表达，而对其余分子表达变化并无影响。Twist可显著上调ABCB1基因的编码产物P-gp蛋白表达。Twist组在奥沙利铂浓度0、0.1、1、5、10 μmol/L刺激HCT116细胞后细胞活力分别为1.00±0.08、0.84±0.09、0.70±0.10、0.53±0.07、0.48±0.06，空载体组分别为1.00±0.07、0.76±0.08、0.58±0.05、0.27±0.04、0.08±0.04，奥沙利铂各浓度刺激HCT116细胞后两组细胞活力比较，P均<0.05。奥沙利铂刺激HCT116细胞后，Twist组肿瘤化疗抵抗相关的调控分子 ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCG2、ERCC1、XRCC1、MSH2、TUBB3、POLH、GSTπ、γ-GT1蛋白相对表达量分别为3.20±0.35、1.10±0.11、1.14±0.18、1.09±0.09、0.88±0.09、1.09±0.12、1.30±0.14、0.98±0.10、1.02±0.13、1.13±0.08、1.42±0.25、1.09±0.08、0.92±0.10、1.29±0.35，空载体组分别为1±0.10、1±0.14、1±0.13、1±0.15、1±0.09、1±0.12、1±0.11、1±0.15、1±0.14、1±0.13、1±0.15、1±0.09、1±0.15、1±0.17，两组ABCB1表达比较，P<0.05。

3 讨论

基因的异常激活是CRC获得恶性表型的始动因素之一，肿瘤细胞的EMT表型转化是化疗抵抗产生原因之一，而EMT相关的驱动分子同时亦可促使肿瘤细胞向干细胞表型转化。肿瘤干细胞具有无限增殖、遭受打击时保持休眠的特点，从而在放化疗刺激下保证存活，并在适当时机再次恶性增殖、转移，导致CRC的复发。然而当前关于结直肠癌的治疗措施仍是传统手术切除及放化疗，进展缓慢，术后复发及放化疗抵抗等远期不良预后仍较常见[19]。肿瘤细胞放化疗抵抗是患者不良预后的主要原因，肿瘤细胞在遭受放化疗的初次打击后，部分细胞残存下来，成为异质细胞群，该群细胞具有增殖及侵袭能力、抗打击能力强的特点。部分细胞获得了肿瘤干细胞特性，肿瘤干细胞具有自我更新和无限增殖的能力，同时其转移能力强大，并可在损伤打击下进行休眠，从而逃避打击[20,21]。

EMT是高度协调的动态过程，以上皮细胞失去少部分或多数上皮特征并呈现间充质表型为特点。上皮细胞向间充质细胞的转化在胚胎发育过程中必不可少，EMT的产生可促使胚胎期细胞间黏附及极性丧失，从而获得迁移和侵入能力。胚胎期细胞的EMT对机体的正常发育有积极作用，而成熟细胞EMT的异常激活则利于肿瘤的发生、侵袭、转移，并获得治疗抵抗力。肿瘤细胞EMT及治疗抵抗时，肿瘤细胞的转录组重编程，众多基因簇表达失衡[22]。通过过表达手段我们发现，扭曲基因Twist可促使HCT116细胞形态转变为梭型，且上调其侵袭能力。Twist可显著上调EMT相关标志物vimentin表达，而抑制上皮相关的E-钙黏蛋白表达，提示Twist可通过转录及翻译层面调控CRC细胞的EMT变化，促使其侵袭并转移至其他组织或器官。

肿瘤细胞EMT相关的部分转录因子snail、Twist可驱动肿瘤干细胞相关基因表达，从而促使肿瘤细胞获得干性[19]。干细胞具有体外培养时成球的特性。本研究结果发现，Twist可促使HCT116细胞成球并可上调肿瘤干细胞标志物Bmi-1、Nanog、CD44表达。肿瘤细胞发生EMT、干细胞表型转换时，其增殖及抗凋亡能力将显著上调，我们的研究证实，过表达Twist的HCT116细胞在遭受奥沙利铂打击时，其活力相较对照细胞显著上调。提示Twist在促使HCT116细胞EMT及干细胞表型转化之后，导致其对化疗药物的打击失去了敏感性。进一步研究发现，Twist对HCT116细胞的化疗抵抗调控作用是通过ABCB1/P-gp途径实现的。既往研究表明，P-gp是能量依赖性“药泵”调节分子，可通过消耗ATP将肿瘤细胞内的化疗药物逆浓度泵至细胞外，从而降低肿瘤细胞内化疗药物浓度，促使肿瘤细胞产生耐药性。

综上所述，Twist可促使结直肠癌HCT116细胞发生EMT表型转化，获得干细胞特性，进一步通过ABCB1/P-gp途径，增强其自身耐药。