GLO1在胰腺癌细胞和胰腺癌干细胞中表达及其对细胞增殖、侵袭的影响

汤海涛,闫继慈,周晓琳

(辽宁省人民医院,沈阳 110015)

胰腺癌(PC)是一种常见的侵袭性恶性肿瘤，是肿瘤相关死亡的主要原因之一[1]。根据2018年发表的最新肿瘤统计学数据显示，PC是全球肿瘤死亡的第七大原因，死亡人数为43万左右，几乎与病例数45万相同[2]。由于缺乏有效可靠的早期检测筛查方法，PC患者确诊时已处于晚期，目前PC患者的治疗效果不佳[3]，因此寻找PC的有效治疗方法是改善患者预后的关键。遗传学研究表明，癌基因的激活和肿瘤抑制基因的沉默在PC发生发展中发挥重要作用[4，5]。研究发现，肿瘤内含有一组细胞亚群，具有较强的自我更新和分化成异质肿瘤的能力，这群细胞为肿瘤干细胞(CSCs)，与PC的恶性行为密切相关，CSCs是驱动肿瘤不断生长的根源，成为肿瘤治疗的一个难点[6]。乙二醛酶Ⅰ (GLO1) 是一种与甲基乙二醛(MG)降解功能相关的细胞保护关键酶，具有重要的肾脏保护作用，在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等常见的肿瘤中已观察到GLO1高表达，并参与肿瘤的增殖、凋亡及侵袭转移等生物学功能[7～9]。而有研究报道GLO1在PC组织中呈高表达[10]，但GLO1在PC中是否具有生物学功能的研究尚未有报道，因此GLO1是否在PC细胞和CSCs的恶性行为调控中有重要作用有待探讨。2017年1月～2018年12月，我们观察了GLO1在PC细胞和CSCs中的表达，探讨其对PC和CSCs增殖、侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂：PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录和SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR试剂盒等均购自日本TaKaRa公司；PC细胞系SW1990、PANC-1、BxPC3和人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7均购自美国ATCC细胞库；L-15、DMEM、RPMI1640培养基和FBS均购自美国Gibco公司；GLO1引物由上海捷瑞生物有限公司设计合成；GLO1 siRNA购自上海生工公司；MTS购自美国Promega公司；Boyden基质胶购自美国BD公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒均购自美国Thermo公司；Nanog抗体(ab109250)、OCT4抗体(ab19857)、SOX2抗体(ab97959)、GAPDH抗体(ab181602)均购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养、PC CSCs的分选与鉴定 L-15+10%FBS培养SW1990细胞，DMEM+10%FBS培养PANC-1、HPDE6-C7细胞，RPMI-1640+10%FBS培养BxPC3细胞，培养条件为37 ℃、5%CO2。将PANC-1细胞培养于无血清培养基中，将培养出的肿瘤球制成单个细胞后，与小鼠抗人CD133抗体包被的磁珠孵育，分选出CD133阳性的细胞，并在无血清培养基中继续培养。采用流式细胞仪检测CSCs中CD133阳性细胞率为94.11%。Western blotting法检测干性标志分子Nanog、OCT4和SOX2在CD133细胞中的表达。

1.3 GLO1 mRNA在PC细胞系和人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7中的表达检测 采用qRT-PCR法。PC细胞系和人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7细胞PBS洗2次完全去除后，加入TRIzol裂解液，冰上完全裂解10 min，将上清移至新的EP管中，加入氯仿完全混合后静置5 min，12 000 r/min、4 ℃离心30 min，将上层水相溶液与等体积的异丙醇混匀，12 000 r/min、4 ℃离心15 min，弃掉液体后用无水乙醇洗涤2次沉淀，加入DEPC水溶解RNA，并将其逆转为cDNA。GLO1正向引物:5′- AGCAGACCATGCTACGAGTGA-3′，反向引物：5′-GAGAGCGCCCAGGCTATTT-3′，GAPDH正向引物:5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′，以cDNA为模板按照说明书进行qRT-PCR操作。以GAPDH作为内参，分析各样品的循环阈值(Ct)， 采用2-ΔΔCt法分析实验数据。

1.4 GLO1蛋白在PC细胞系和人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7中的表达检测 采用Western blotting法。细胞PBS洗2次完全去除后，加入蛋白RIPA裂解液，冰上完全裂解10 min后，将裂解液转至EP管中，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，上清液为蛋白裂解液，BCA检测试剂盒检测蛋白浓度后煮沸变性，以50 μg蛋白的质量上样，SDS-PAGE电泳进行蛋白分离，湿转，5%脱脂牛奶在室温封闭1 h，按抗体说明书进行一抗的稀释，并4 ℃孵育过夜，TBST洗3次后，室温孵育二抗1 h，采用ECL化学发光法曝光条带。

1.5 细胞转染及GLO1 mRNA表达检测 将呈对数生长期时的PANC-1细胞、CSCs细胞胰酶消化后铺至6孔板中，分为si-NC组和si-GLO1组，按照说明书将si-NC和GL01 siRNA转染试剂与脂质体2000混合后转染至对应组别的细胞中，放至培养箱中培养。qRT-PCR法检测GLO1 mRNA在si-NC组和si-GLO1组中的表达。

1.6 细胞增殖能力检测 采用MTS实验。细胞转染48 h后，收集细胞进行计数，以每孔1 500个细胞接种于含150 μL培养基的96孔板中培养，设置6个复孔，在细胞贴壁第0、24、48、72和96 h时每孔加入30 μL MTS试剂，37 ℃细胞培养箱中孵育2 h后采用酶标仪检测各孔490 nm处的光密度(OD)值，以时间为横座标，OD值为纵坐标，绘制细胞存活曲线。

1.7 细胞侵袭能力检测 采用Boyden实验法。细胞转染48 h后，收集两组细胞无血清培养基洗3次后进行计数，以每孔1×105个细胞制成100 μL无血清培养基的细胞悬液，接种于含有Boyden基质胶的Transwell小室上室聚碳酸酯微孔膜的上室面，下室加入500 μL完全培养基作为趋化因子，放至培养箱中培养，显微镜下观察细胞穿至下室超过10个时终止培养，PBS将上室面的细胞洗掉后中性甲醛固定10 min，苏木素染色，晾干后取出聚碳酸酯微孔膜。显微镜下随机计数3个视野膜上的细胞数目，取其均值代表细胞转移能力。

1.8 PI3K/AKT信号通路关键蛋白的检测 采用Western blotting法。细胞PBS洗2次完全去除后，加入蛋白RIPA裂解液，冰上完全裂解10 min后，将裂解液转至EP管中，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，上清液为蛋白裂解液，BCA检测试剂盒检测蛋白浓度后煮沸变性，以50 μg蛋白的质量上样，SDS-PAGE电泳进行蛋白分离，湿转，5%脱脂牛奶在室温封闭1 h，按抗体说明书进行pPI3K和p-AKT一抗的稀释，并4 ℃孵育过夜，TBST洗3次后，室温孵育二抗1 h，采用ECL化学发光法曝光条带。

2 结果

2.1 PC CSCs的鉴定 Western blotting检测结果显示，干性标志分子Nanog、OCT4和SOX2在CD133阳性细胞中的相对表达量分别为5.24±0.29、3.99±0.25、7.62±0.98，在CD133阴性细胞中的相对表达量分别为1.01±0.02、1.04±0.05、1.05±0.03，Nanog、OCT4和SOX2在CD133阳性细胞中的表达高于在CD133阴性细胞中的表达(P均<0.05)。

2.2 GLO1在PC细胞系和人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7中的表达 qRT-PCR检测结果显示，GLO1 mRNA在PC细胞系SW1990、PANC-1、BxPC3和HPDE6-C7中的相对表达量分别为2.13±1.22、11.30±0.93、8.27±0.95、1.00±0.05，GLO1 mRNA在PC细胞系SW1990、PANC-1、BxPC3中的表达均高于在人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7中的表达(P均<0.05)，其中在PANC-1中的表达最高。Western blotting检测结果显示，GLO1蛋白在PC细胞系SW1990、PANC-1、BxPC3和HPDE6-C7中的相对表达量分别为2.98±0.19、14.32±1.37、9.01±2.10、1.00±0.01，GLO1蛋白在PC细胞系SW1990、PANC-1、BxPC3中的表达均高于人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7中的表达(P均<0.05)，其中在PANC-1中的表达最高。

2.3 si-NC组和si-GLO1组中GLO1 mRNA表达比较 PANC-1细胞中，GLO1 mRNA在si-NC组和si-GLO1组的表达量分别为1.00±0.00、0.22±0.03，GLO1 mRNA在si-GLO1组中的表达低于在si-NC中的表达(t=28.63，P=0.000)。CSCs细胞中，GLO1 mRNA在CSCs(CD133阳性)、PANC-1(CD133阴性)中的表达量分别为8.67±1.01、1.00±0.05，二者比较差异有统计学意义(t=24.61，P=0.000)。PC CSCs细胞中，GLO1 mRNA在si-NC组、si-GLO1组的相对表达量分别为1.01±0.02、0.31±0.11，GLO1 mRNA在si-GLO1组中的表达低于si-NC组中(t=17.35，P=0.001)，

2.4 GLO1 siRNA对PC细胞PANC-1增殖的影响 si-NC组0、24、48、72、96 h时OD值分别为0.36±0.04、0.53±0.06、0.68±0.12、0.99±0.11、1.28±0.14，si-GLO1组0、24、48、72、96 h时OD值分别为0.36±0.04、0.40±0.14、0.50±0.13、0.59±0.11、0.69±0.15，与si-NC组相比，48、72和96 h时si-GLO1组细胞增殖能力减慢(P<0.05)。

2.5 GLO1 siRNA对PC细胞PANC-1侵袭能力的影响 GLO1 siRNA转染PANC-1细胞后，si-NC和si-GLO1组细胞穿膜数分别为(85.94±18.97)、(51.03±12.38)个。si-GLO1组细胞侵袭能力低于si-NC组(P<0.05)。

2.6 GLO1 siRNA对PC CSCs细胞增殖的影响 si-NC组0、24、48、72、96 h时OD值分别为0.29±0.03、0.50±0.07、0.71±0.11、1.02±0.10、1.32±0.13，si-GLO1组分别为0.29±0.04、0.37±0.08、0.47±0.07、0.59±0.12、0.67±0.10，48、72、96 h时OD值比较，P<0.05。GLO1 siRNA转染CSCs后，与si-NC组相比，si-GLO1组细胞增殖能力减慢(P<0.05)。

2.7 GLO1 siRNA对PC CSCs侵袭能力的影响 GLO1 siRNA转染CSCs后，si-NC组和si-GLO1组细胞穿膜数分别为(53.28±11.35)、(36.21±9.21)个。si-GLO1组细胞侵袭能力低于si-NC组(P<0.05)。

2.8 沉默GLO1 siRNA对PI3K/AKT信号通路的影响 在PANC-1细胞中，si-NC组、si-GLO1组pPI3K蛋白相对表达量分别为1.00±0.01、7.98±1.24，两组比较差异有统计学意义(t=15.67,P=0.021);pAKT蛋白相对表达量分别为1.00±1.00、14.35±2.04，两组比较差异有统计学意义(t=23.98,P=0.007)。在CSCs细胞中，si-NC组、si-GLO1组pPI3K蛋白相对表达量分别为1.00±0.00、11.04±2.57，两组比较差异有统计学意义(t=19.54,P=0.011)；pAKT蛋白相对表达量分别为1.00±0.05、19.87±3.04，两组比较差异有统计学意义(t=32.05,P=0.001)。

3 讨论

目前PC的发病机制尚未完全明确，从分子水平研究PC发生发展的机制是寻找PC治疗方法的新途径。已有研究报道PC中存在潜在的药物靶点，GPR68又称卵巢癌G蛋白偶联受体1，在包括PC的多种恶性肿瘤中表达上调，调控多种信号通路，密切参与肿瘤的发生和转移，是治疗肿瘤的潜在新型治疗靶点，开发靶向GPR68的药物具有较好应用前景[11]。密蛋白CLDN7在PC组织和细胞系中高表达，敲除PC细胞中CLDN7的表达可诱导细胞周期阻滞于G1期，并能降低细胞外信号调节激酶1/2的去磷酸化，最终导致细胞增殖抑制，可作为用于治疗PC的新型分子靶标[12]。

GLO1基因位于6p21,3-6p21,2，具有核苷酸多态性，其核苷酸位置332(rs4746)处的单核苷酸多态性使其mRNA外显子4中的腺苷/胞嘧啶交换，导致处于氨基酸蛋白质序列第111位的Ala变为Glu[13]。GLO1属于氧化还原系统酶，是一种谷胱甘肽依赖性酶，广泛表达于各种组织中，同时是GLO1糖酵解副产物甲基乙二醛(MGO)代谢过程中的关键限速酶，GLO1在限制MGO的细胞内积累和细胞毒性方面起关键的细胞保护作用，GLO1表达异常会导致MGO的代谢平衡失调，进而引起二羰基应激产生晚期糖基化终产物(AGEs)，而AGES修饰蛋白的累积导致肥胖、心血管及糖尿病等与年龄相关的疾病[14]。研究发现，AGEs可导致自由基和活性氧的产生，而自由基和活性氧与肿瘤的发生和恶性进展密切相关[15]，此外，GLO1被报道在多种肿瘤中表达增加[7～9]，Jandial等[16]报道，采用shRNA靶向抑制多形性胶质母细胞瘤细胞中GLO1的表达，可致AGEs免疫球蛋白样受体的表达显著升高，引起肿瘤细胞凋亡，抑制GLO1可能在最具攻击性且难以治疗的神经恶性肿瘤治疗中有潜在价值。本研究结果显示，与邻近的癌旁组织相比，GLO1在PC组织中呈高表达。而GLO1在PC中发挥的作用及相关机制却鲜有报道。

我们采用qRT-PCR方法检测GLO1 mRNA在PC细胞系中的表达，结果显示GLO1 mRNA在PC细胞系SW1990、PANC-1、BxPC3中的表达均高于在人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7中的表达，差异有统计学意义，同时我们采用Western blotting法检测GLO1 蛋白在PC细胞系中的表达，结果同样显示GLO1 蛋白在SW1990、PANC-1、BxPC3中的表达均显著高于HPDE6-C7中，GLO1在PC中表达上调，表明GLO1可能为促癌基因。而对于GLO1是否具有促癌基因功能的研究，我们选择qRT-PCR和Western blotting法检测，结果均显示PC细胞系中GLO1表达最高的PC细胞PANC-1作为工具细胞，采用小干扰RNA(siRNA)技术转染PANC-1细胞，干扰细胞中GLO1表达后观察细胞的增殖和侵袭能力，MTS实验及Boyden实验结果显示，干扰GLO1的表达，PANC-1细胞的增殖和侵袭能力均显著降低，表明GLO1具有生物学功能。快速增殖、高侵袭转移和对化疗药物的耐药性是PC患者死亡的重要原因[17]，而研究表明,肿瘤增殖、侵袭转移和耐药等恶性表型与肿瘤中存在的细胞亚群CSCs密切相关[6]，CSCs具有较强的自我更新和分化为异质肿瘤的能力，越来越多的证据表明，PC中同样存在CSCs，且可作为治疗PC的药物靶点，Ma等[18]报道，α-Mangostin可通过抑制细胞增殖、侵袭和转移能力而靶向抑制PC CSCs，有效治疗PC。此外，Tamori等[19]发现，GLO1对ALDH1阳性的乳腺癌干细胞存活至关重要，是治疗基底样乳腺癌的潜在治疗靶点，在PC中GLO1是否可以靶向CSCs作为潜在治疗靶点尚有待进一步研究。

CSCs属于肿瘤细胞中的一小部分侧群，需一定的技术手段将其分离出，目前CSCs的分离方法主要为无血清悬浮培养和基于CSCs表面免疫学分子分选。无血清悬浮培养可将自我更新能力较强的细胞分离出，而PC中CSCs表面会表达CD133的免疫学分子[18]，本研究结合两种方法从PC细胞系PANC-1筛选出94.11%的CD133阳性细胞，采用Western blotting检测CD133阳性细胞中干性标志蛋白Nanog、OCT4和SOX2的表达显著升高，表明CD133阳性细胞为CSCs。而qRT-PCR检测结果发现，GLO1 mRNA在CSCs中的表达显著高于PC细胞PANC-1中，提示GLO1在CSCs中可能具有重要的生物学功能，同样采用siRNA干扰CSCs中GLO1表达后，MTS实验及Boyden实验结果显示，抑制GLO1基因表达后CSCs增殖和侵袭能力均下降，CSCs的生物学特性受抑。可见干扰GLO1表达能抑制PC细胞和CSCs的增殖和侵袭，但具体的作用机制仍需进一步研究。研究报道，调控肿瘤增殖和侵袭转移的部分经典信号通路在调控CSCs生物学特性中同样发挥重要作用[20]，其中PI3K/AKT信号通路在调控PC细胞恶性生物学行为方面发挥关键作用。本研究发现，干扰GLO1表达后细胞中pPI3K和p-AKT促癌蛋白表达受抑。表明GLO1可能通过激活PI3K/AKT信号通路促进PC细胞和CSCs的增殖和侵袭。

综上所述，GLO1在PC细胞系和CSCs中呈高表达，GLO1可能通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制PC细胞和CSCs的增殖与侵袭，GLO1有望作为治疗PC的候选靶点。