肠道类器官的培育、功能、在肠疾病模型和药物测试中的应用研究进展

王雨佳，沈洪

(南京中医药大学附属医院，南京 210000)

肠道是消化器官中最长的管道，与一系列肠道疾病有关，如慢性炎症性肠病(IBD)、肠梗阻、痢疾、结直肠癌(CRC)等[1,2]。尽管大量肠疾病研究已在永生化细胞或动物模型中开展，但由于肠道不同部位的组织具有独特的结构和生理功能，使用单一的离体细胞模型或动物模型，很难模拟人体肠道的结构、功能以及疾病发生过程，导致研究结果具有局限性。肠道是来源于内胚层的重要器官，2007年Clevers团队首次证明LGR5+干细胞位于肠道隐窝的基部，形成肠道干细胞的生态位，可分化形成肠道上皮细胞，如肠细胞、杯状细胞、潘氏细胞和内分泌细胞[3]。随后，该团队首次在离体3D培育体系中，将肠道干细胞或隐窝，诱导形成含有潘氏细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞的空腔样“迷你肠”，即肠道类器官。肠道类器官培育方法的开创性提出，不仅可用来研究肠道发育进程，而且为患者提供了个体化疾病模型或个体化肠道组织修复供体，可用于精准医学和肠道疾病特异性药物研究。现将肠道类器官的培育、功能及其在肠疾病模型和药物测试中的应用研究进展情况综述如下。

1 肠道类器官的培育、功能

近些年，器官样组织培育平台得到快速发展，以模拟在体组织发育进程、构建疾病模型等，如肝、胰腺、肾脏、中枢神经系统及肠道类器官[4]。在过去十年中，体外培养和维持肠上皮细胞(IEC)的技术取得重大突破。同时LGR5+干细胞的特异性标记和肠道干细胞生态位的确定[3]，为3D肠道器官样组织的培育奠定基础，使得离体扩增肠上皮成为可能。2009年，Clevers团队首次培养出了3D肠道类器官[5]。离体的肠道干细胞或隐窝在基质胶以及多种生长因子中培养可不断增殖，并且能够分化出潘氏细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞等各种成熟细胞，不仅自我组建形成具有多个隐窝的空腔样结构，而且保留了肠道干细胞的自我更新及分化能力[5]。随后，2015年，Wang等[6]利用成体干细胞体外培养和气液界面三维分化技术，成功培养出可在体外长期保持良好自我更新状态的干细胞，适用于所有柱状上皮组织来源的成体干细胞的体外培养和分化，进行气液界面培养分化后，可自发形成各种3D肠上皮组织，如胃、小肠、结直肠、肝管、胰腺导管等组织器官，该上皮组织具有完善的上皮屏障结构和功能。

1.1 肠道类器官的培育方法 大量研究[7]表明，在蛋白因子和细胞外基质支架供应充足的情况下，来源于小鼠、人或其他种属的IEC(包括小肠、结肠和胎儿肠)，均可自我组建形成独特的3D组织样结构，而且干细胞扩增速度非常快。目前，肠道类器官有两种方法培育而得，即通过成体患者供体的肠道隐窝分离获得，或者通过人胚胚胎干细胞(hESCs)或人诱导性多能干细胞(hiPSCs)离体分化而得。

无论是原代组织，还是干细胞来源的类器官，其培养条件基本相同，基础培养基都包含DMEM/F12、N2、B27、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸。此外，还需要向基础培养基中额外添加表皮生长因子(EGF)、头蛋白(Noggin)、胃分泌素(gastrin)等生长因子，这对于调节肠黏膜生长和IEC的增殖是必需的。另外，Wnt3a的存在对于调节肠道干细胞自我更新、增殖和分化是至关重要的，因为肠隐窝干细胞中LGR5的表达依赖于经典的Wnt信号传导途径，且由R-Spondin-1和Noggin的BMP4抑制调节[8]。

成体肠组织来源培育肠道类器官，可在内窥镜检查或手术切除期间，从肠道活检中分离获得肠隐窝[9,10]。隐窝从上皮手动分离后，包埋到含有Wnt、R-Spondin、EGF、Noggin的MatrigelTM中，进而在包含所有添加因子和生长因子的组织培养基中生长。在接下来的7～10 d培养过程中，隐窝逐渐伸长并扩增，形成首个器官样结构。成熟的肠样或结肠样组织，不仅包含LGR5+干细胞，还包含括肠细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞和潘氏细胞等称成熟细胞。人干细胞来源的肠道类器官，通过hESCs或hiPSCs分化发育形成肠上皮获得。hESCs或hiPSCs先后经历终末内胚层、后肠内胚层、肠祖细胞的2D分化发育培养阶段，之后转移到MatrigelTM的3D培养平台，细胞自发地重排形成肠道类器官。

1.2 肠道类器官的功能 肠道类器官的功能分析已在多种实验中开展。由细胞簇自我组建形成的3D样肠道类器官，可重现其在体原生组织的重要特征，包括与原生肠上皮相似的、由隐窝和绒毛组成的高度折叠的上皮结构[7]。细胞簇一旦嵌入到基质胶(MatrigelTM)中，开始自我组建，上皮的腔表面朝向类器官的中心，基底侧与MatrigelTM和周围的培养基接触，逐渐形成肠道类器官。肠道类器官不仅包含在体原生肠组织中的几乎全部细胞类型，而且表现出与在体相似的功能，如黏液产生、吸收和分泌功能[11]，可用于研究内稳态和疾病状态下不同细胞之间相互作用的复杂性。此外，肠道类器官还可模拟在体上皮再生能力，随着凋亡细胞逐渐释放到类器官腔中，隐窝内的LGR5+细胞分化形成新的细胞，以补充上皮细胞。

肠细胞的重要基础功能是运输水和电解质穿过肠屏障。实验表明，离体状态下，衍生形成的缺乏顶端转运蛋白SGLT-1或PEPT1的肠道类器官，可抑制D-葡萄糖、D-果糖和肽类转运透过上皮膜，证明其作为营养吸收和药物转运机制模型的潜在用途[12]。肠上皮的渗透性可影响小分子穿透肠屏障的扩散、阻止细菌通过血流移位。最近一项研究[13]证明，肠道类器官可模拟上皮的通透性。通过将荧光标记的葡聚糖注射入肠腔，同时使用自动显微镜，可实时捕获并量化活细胞变化情况、腔表面的断裂等。该技术可用于研究慢性炎症条件下和细菌入侵期间的肠渗透性的改变。毛喉素诱导的肿胀实验已在类器官中开展，证明囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)离子通道的功能[14]。

2 肠道类器官在肠疾病模型和药物测试中的应用

肠道类器官于2009年首次提出，在近十年的发展中，该技术不仅逐渐应用于研究正常肠功能，还用来研究肠道功能障碍、肠道疾病以及药物测试平台构建。

2.1 肠道类器官在肠疾病模型中的应用

2.1.1 IBD IBD是一种病因不十分清楚、可影响整个胃肠道的慢性的进行性、复发性疾病，由胃肠道中对抗抗原的先天性和适应性免疫应答失调而引起。IBD分为溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。UC仅限于结肠，是结肠黏膜层和黏膜下层的连续性炎症，先累及直肠，逐渐向全结肠蔓延；CD可影响消化道的任何区域，为非连续性全层炎症，最长累及的部位为末端回肠、结肠和肛周[15]。在活动性IBD期间，小肠和大肠均可能高度发炎，导致上皮细胞破坏和消化能力下降。IBD患者来源的肠道类器官，可用于模拟IBD患者中先天性免疫系统的调节模式，以确定新型疗法降低疾病严重性的可能性。

肠道类器官主要由上皮组成，包括肠干细胞自我更新的生态位，但是缺乏在体中维持肠整体结构和功能的间充质组织、免疫和神经细胞。在体外培养环境下，iPSCS分化获得的诱导性肠道类器官，移植到小鼠肾囊内后，可产生间充质，进而分化形成平滑肌和成纤维细胞[11]。这一进程虽然能代表体内的肠结构，但是耗时较久，且缺乏最常见的肠道疾病IBD所必需的免疫细胞。为模拟免疫细胞和上皮细胞的相互作用，类器官可以与免疫细胞共培养，如分离的上皮内淋巴细胞，以研究炎症性疾病的病理学。

2.1.2 短肠综合征(SBS) SBS通常由于IBD、CRC或缺血性疾病导致的大肠部分切除而引起，有时在出生时就存在。SBS患者的肠上皮表面积显著减少，伴有吸收障碍、腹泻和营养不良等症状。先天性SBS患者，与CLMP基因的遗传基础有关。患者来源的小肠类器官，为更加深入地研究遗传易感性提供了可能性，包括发育过程中肠道伸长受损的分子机制[16]。此外，肠道类器官与延长小肠的组织工程技术相结合，可在不考虑SBS病因的情况下，为恢复肠道正常功能提供了潜在的方法。

2.1.3 乳糜泻 乳糜泻是一种自身免疫疾病的例子，主要影响小肠对麦胶蛋白(麸质食物)的消化，进而由于吸收障碍引起炎症，导致一系列其他连续性症状。若在饮食中不排除所有麸质食物，长时间的炎症可能会导致骨质疏松症、癌症等。乳糜泻患者来源的类器官，可用于深入研究遗传素质和疾病驱动机制。乳糜泻患者中肠屏障的完整性，也可通过类器官进行研究[17]。类似地，患者来源的类器官可用于构建药物筛选平台，以鉴定新型疗法。

2.1.4 憩室病 憩室病是指肠上皮突出形成的囊状结构，通常发生在乙状结肠中，由肠道机械性损伤导致的功能丧失引起[7]。憩室引发的感染和发炎，可能导致患者出现发烧、疼痛、恶心和腹泻。目前，憩室病的病因学尚不清晰，可能是由于低纤维饮食导致的大肠过度压力引起，也可能是先天性遗传因素引起。因此，通过相对无创地肠组织活检，培育获得患者组织来源的类器官，不仅可用于研究憩室病发病机理的遗传因素，而且可通过与健康的肠组织进行比较，以确定遗传素质和功能差异。由于憩室病疾病进程的力学性能，可对个体化类器官施加机械性压力，模拟肠道上皮对不同水平下拉伸力的反应。但是，由于在体肠上皮周围涉及间质和肌肉层，单独的肠道类器官不适合模拟憩室疾病进程，因此需要组织工程方法与类器官技术相结合来模拟憩室病。

2.1.5 囊性纤维化(CF) CF是一种由CFTR突变引起的遗传性疾病。虽然许多研究表明CF主要作用在肺部，但在肠中也可以观察到液体和电解质稳态的改变。研究表[18]明，CFTR突变小鼠和人类CF患者的直肠衍生培养物中可检测到CFTR介导的表型。因此，利用患者来源的肠道类器官，结合毛喉素诱导的肿胀实验和电压门测量实验，可精确地测量流体和离子运输的改变[14,18]；同时，适用于构建CF药物筛选平台，以确定CFTR增效剂和基因治疗的个体药物反应[7,14]。

2.1.6 结肠直肠癌(CRC) CRC是全世界第三最常见的疾病，具有较高的致死率。CRC疾病因素复杂，但是长期的CD或UC可显著增加患CRC的风险。尽管越来越多的类器官被用作模拟CRC模型，但是目前的CRC模型不能再现早期疾病进展，也不能表征肿瘤的异质性。因此，类器官技术可与基因编辑技术相结合，将突变基因引入到目的基因中，例如利用CRISPR/Cas9编辑APC肿瘤抑制基因[19,20]；或将基因修饰的类器官移植到小鼠体内，测量肿瘤发育和侵袭的体内机制[21]。

2.1.7 食管腺癌 Barrett食管作为癌前病变，在数十年的再生生长过程中，可逐渐演变为食管腺癌。2015年，Wa团队首次在体外3D培养分化获得Barrett食管干细胞，进而与同一病人来源的胃干细胞或食道干细胞相比，获得其特异的基因表达谱[22]。而且Barrett食管干细胞能分化为肠化生组织的各种细胞类型，且移植到小鼠体内后，可形成类似于人食管腺癌测肿瘤。因此，以Barrett食管干细胞作为食道腺癌的靶点，可用于肿瘤预防和治疗研究；以Barrett食管干细胞分化为肠化生组织，可模拟食管腺癌疾病进程。

2.1.8 放射性肠损伤 除以上疾病模型外，类器官模型还可用来研究肠道损伤，例如放射性肠炎。临床前动物研究表明，辐射后损伤的小肠隐窝增殖再生与转录阻遏物MTG16、血管心外膜蛋白BVES、STAT5活化有关。因此，可利用辐射小鼠产生类器官以及直接辐射类器官，建立放射性肠炎模型，用于放射治疗后的敏感位点、肠道活力、干细胞功能和修复研究。

2.1.9 细菌和病毒感染模型 肠道是人体抵御外界病原感染的关键屏障，通过肠道传播的病毒，包括诺如病毒、轮状病毒等，都是重要的致病原。但由于细菌或病毒的附着位点通常位于顶端表面，最常用的3D培养方法不能用于模拟细菌和病毒感染。为克服这一点，Wang等[6]利用成体干细胞体外培养和气液界面3D分化技术，不仅在体外更好地模拟和构建了肠道上皮的3D结构，而且模拟了艰难梭菌感染肠道而导致的假膜性结肠炎。该模型的建立，有助于从病理组织学变化、基因表达、肠上皮屏障功能障碍等方面深入解析假膜性结肠炎的发生过程和致病机理，为开发新型药物和治疗方案提供重要的理论依据。也有研究表明，在Transwells中将肠状结构培育2D单层细胞，破坏其3D结构但保留分化能力，允许极化并暴露顶端表面。这一模型，不仅可用于研究屏障功能、转胞吞作用、细胞极化，也使得该模型易于感染、并检测与感染相关的附着脱落损伤。

2.2 肠道类器官在药物测试中的应用 人体肠黏膜是药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性的关键位点，但在体外难以重现。尽管肠道类器官可用于肠道研究，包括器官发育、疾病模型和再生医学，但是缺乏在体解剖学和生理学特征。最明显的特征是，朝向内皮方向的类器官闭合腔使顶端表面难以实现吸收、分布、代谢和排泄测定。最近一项研究显示，通过使用离体细胞外基质或多细胞合成支架的去细胞化和再细胞化构建的3D支架，可显著地增加发育和疾病模型的准确性；该方法具有诸多优势，不仅为细胞培养成管状结构提供了基础，使其具有更加精确的上皮样图案和一致的细胞数量，而且可根据研究的肠道区域或模拟的疾病模型，改变细胞组成，为局部区域的肠道提供了一定的解剖学特征。此外，在肠道组织离体培养中，引入生物打印技术，生成由人类原发性IEC和肌成纤维细胞组成的3D肠组织，可模拟在体原生肠的结构和功能。该3D肠组织，具有紧密连接和特化上皮细胞类型的极化上皮，表达功能性和诱导型CYP450酶，不仅发育形成生理屏障，区分高渗透性和低渗透性化合物，而且具有功能性P-gp和BCRP转运蛋白。在生化和组织学方面，3D肠组织可以对化合物诱导毒性和炎症损伤产生反应。这一方法的开创性提出，可与现有的临床前测定相兼容，为增强药物研发中的安全性和功效预测提供新的临床试验模型。

综上所述，成体组织活检或多能干细胞定向诱导分化产生的肠道类器官，表型稳定，培养操作相对简单，可用于原生肠道发育、个体化疾病模型、精准医学和肠疾病特异性药物测试等研究。尽管目前的类器官培养技术不允许组装复杂的多细胞类器官，具有一定的局限性，但是肠道类器官相对于组织培养细胞系仍有许多优势。未来，肠道类器官与CRISPR/Cas9基因编辑、3D生物打印等新兴技术结合，可构建更加复杂、更加精确的肠疾病研究平台，在肠道疾病基因治疗和移植应用中发挥更大的潜力，更好地用于疾病模拟、药物发现和个性化医疗。我们相信，随着类器官培育和技术的快速发展，肠道类器官在人类肠疾病研究和组织再生医学中，将发挥不可估量的价值。