人源酸敏感离子通道1a介导酸引起细胞凋亡的研究

徐媛媛，李文娜，翟玉荣，莫镇涛，李意奇，李俊明，肖 璐，李彩兰

(遵义医科大学 珠海校区，广东 珠海 519041)

酸敏感离子通道(Acid-sensing ion channels,ASICs)是一类配体门控Na+通道，广泛分布于中枢和外周神经系统。能被酸激活产生内向电流，对阳离子透过能力Na+>Ca2+>K+>H+[1-2]。目前发现，ASICs有6个亚型(ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3以及ASIC4)，其中，ASIC1a、ASIC2a、ASIC2b在中枢神经元表达较多[3-4]。前期研究发现，在大脑缺血过程中，ASIC1a被酸激活，引起细胞内钙超载，进一步引起神经元损伤，在大脑中动脉闭塞(MCAO)引起的脑缺血模型中，通过注射ASIC1a特异性阻断剂可以减少梗死面积，因此，ASIC1a是介导酸引起神经元损伤的关键亚型，ASIC1a有望作为减轻酸引起神经元损伤的新型分子靶点[5-7]。

研究发现，人源与小鼠源ASIC1a有98%氨基酸序列相同，另2%氨基酸决定人源与小鼠源ASIC1a在功能的差异：对CHO细胞转染人源或小鼠源ASIC1a基因，结果显示，与小鼠源ASIC1a相比，人源ASIC1a介导酸引起的膜电流增加，细胞内钙离子浓度升高，继而引起细胞损伤加重，导致这些功能存在差异的机制是由于人源ASIC1a的细胞膜转运效率更高，进一步发现第285位氨基酸是决定人源与小鼠源ASIC1a膜转运差异的关键氨基酸位点[8-9]。虽然人源ASIC1a比小鼠来源ASIC1a介导由酸引起的细胞损伤更大，但并没有进一步证明是何种损伤，细胞凋亡或细胞坏死？因此本课题旨在比较：在不同种类细胞中，人源与小鼠源酸敏感离子通道1a(ASIC1a)介导酸引起的细胞凋亡，为开发ASIC1a特异性阻断剂提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 实验细胞及质粒：CHO细胞、COS7细胞(购于ATCC)，新生小鼠品系为野生型C57BL/6(购于广东省医学实验动物中心)，人源ASIC1a(hASIC1a)、小鼠源ASIC1a(mASIC1a)、GFP质粒(GFP)(美国南阿拉巴马大学查向明教授惠赠)。主要试剂：F12、DMEM培养基(Hyclone)，碘化丙啶、磷酸钙转染试剂盒、Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)，Neurobasal、B27、Opti-MEM和胎牛血清(Gibco)，Sulfo-NHS-Biotin和NeutrAvidin Beads(Pierce)，MTT试剂盒(Sigma)，山羊来源ASIC1和小鼠来源Tubulin一抗(Santa Cruz)，二抗(Thermo Fisher Scientific)。主要仪器：荧光显微镜(Olympus)，酶标仪(Molecular Device)，免疫印迹实验仪(Bio-Rad)等。

1.2 细胞培养与转染 CHO细胞培养基为F12加10%的胎牛血清，COS7细胞培养基为DMEM加10%胎牛血清，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。转染前1 d，对细胞进行传代，将细胞种植在96孔板或60 mm培养皿中，次日，用Lipofectamine2000混合目标质粒，按比例(2∶1)对CHO细胞或COS7细胞进行转染，ASIC1a与GFP 质粒DNA比例为(3∶1)，总量为0.125～0.25μg /孔或2～5μg /60 mm培养皿。4～6 h之后，加入正常培养基，放回培养箱培养24 h，转染效率达到80%以上可用于后续实验。

1.3 原代皮层锥体神经元培养与转染 取新生鼠，分离皮层组织，加入0.075%胰酶，37℃，消化2 min。加入10%马血清终止消化，低速离心，弃上清。吹散种植液悬浮的组织团，收集上层细胞，低速离心，种植液重悬细胞沉淀，活细胞计数，种植神经元，3～4 h后，换培养液。后续每3天半量换液，7 d可进行转染。用CaCl2对神经元进行转染，按照转染试剂盒的实验方法，在EP管中加入15 μg 目标质粒，40 μL H2O，85 μL 50 M CaCl2，混合均匀后加到含125 μL HBS的EP管中，室温孵育30 min。将混合好的DNA、CaCl2混合物感染神经元，每孔25 μL，DNA量为1.5 μg/孔。转染时间为1 h，换为正常培养基，继续培养72 h，被转染过的神经元用于后续实验。

1.4 细胞酸处理与PI染色 对细胞或神经元进行酸处理，用pH7.4或pH6.0 ECF缓冲溶液处理COS7细胞和神经元，分别用pH7.4或pH6.0或pH6.0+PcTx-1 ECF缓冲液处理CHO细胞，酸细胞处理2 h、神经元1 h，酸处理之后换回正常培养基，次日PI染色、拍照。经酸处理的COS7细胞和神经元，加入PI溶液，孵箱孵育10 min，转染ASIC1a和GFP的细胞呈绿色荧光，凋亡细胞被PI标记呈红色荧光，统计PI阳性细胞比率=黄色细胞数量/绿色细胞数量。

1.5 荧光显微镜拍照 经过酸处理的CHO细胞，24 h之后绿色荧光细胞丢失，通过荧光显微镜拍照，计算细胞死亡率，实验方法见文献[8,10]，计算公式为：细胞死亡率%=(pH7.4细胞数量-pH6.0细胞数量)/pH7.4细胞数量×100%，或(pH7.4细胞数量-pH6.0+PcTx-1细胞数量)/pH7.4细胞数量×100%。

1.6 MTT实验 在细胞培养液中加入500 μg/mL MTT溶液，3～4 h后，加入150 μL DMSO室温震荡15 min，测定在570 nm波长的吸光度。以正常对照组培养物吸光值作为100%，处理组培养物吸光度占对照组吸光度的比值反映细胞存活情况。

1.7 细胞膜蛋白表面生物素标记以及亲和素沉淀分离 经转染的CHO细胞，加入1.5 mL，0.5 mg/mL Suflo-NHS-LC-生物素溶液，4℃旋转孵育30 min，加入甘氨酸终止反应，加入300 μL NeutrAvidin缓冲液，4℃旋转孵育过夜。次日，其中200 μL混合蛋白的NeutrAvidin缓冲液再混合40 μL链亲和素琼脂糖珠，用于膜蛋白分离，另外100 μL为总蛋白，进行Western blot实验。经蛋白定量，加入上样缓冲液，制胶，电泳，电转，封闭，孵育一抗，抗体稀释比例：ASIC1(1∶1 000)、tubulin(1∶30 000)，润洗，孵育二抗(anti-goat 1∶12 000，anti-mouse 1∶12 000)，润洗，显影，进行蛋白定量分析。

1.8 统计学分析 实验分为采用成对T检验来检查两组数据的差异，数据的表示方式采用均值±标准误(MEAN±S.E.M)表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人ASIC1a与鼠ASIC1a介导酸引起的COS7细胞凋亡比较 结果显示(见图1)，转染鼠ASIC1a的细胞经pH6.0处理之后，PI阳性细胞比率为(24.7±2.1)%，转染人ASIC1a的细胞经pH6.0处理之后，PI阳性细胞比率为(37.3±4.3)%，与鼠ASIC1a相比，PI阳性细胞比率显著性增加(P<0.05)。

转染ASIC1a呈绿色，PI标记凋亡细胞为红色，颜色合并，与鼠ASIC1a相比，*：P<0.05；n= 5。图1 人ASIC1a与鼠ASIC1a介导酸引起的COS7细胞凋亡比较

2.2 人ASIC1a与鼠ASIC1a介导酸引起的神经元凋亡比较 结果显示(见图2)，转染鼠ASIC1a的神经元经pH6.0处理之后，PI阳性细胞比率为(18.7±3.3)%，转染人ASIC1a的神经元经pH6.0处理之后，PI阳性细胞比率为(38.8±6.1)%，与鼠ASIC1a相比，PI阳性细胞比率显著性增加(P<0.05)。

转染ASIC1a呈绿色，PI标记凋亡细胞为红色，颜色合并，与鼠ASIC1a相比，*：P<0.05；n= 5。 图2 人ASIC1a与鼠ASIC1a介导酸引起的神经元凋亡情况比较

2.3 人ASIC1a与鼠ASIC1a介导酸引起的CHO细胞损伤比较 结果显示(见图3)，转染鼠ASIC1a的细胞死亡率为(20.7±2.0)%，转染人ASIC1a细胞死亡率为(42.1±3.0)%，与鼠ASIC1a相比，细胞死亡率增加，且具有显著性差异(P<0.001)；运用ASIC1a特异性阻断剂PcTx-1，可显著性减少人源与鼠源ASIC1a由pH6.0引起的细胞损伤(P<0.05，P<0.001)。

与鼠ASIC1a相比，###：P<0.001，n=10，19；鼠ASIC1a，与pH6.0相比，*：P<0.05，n=23；人ASIC1a，与pH6.0相比，***：P<0.001，n=14。图3 人ASIC1a与鼠ASIC1a介导酸引起的CHO细胞损伤情况比较

2.4 转染人源ASIC1a 的CHO细胞活力降低 结果显示(见图4)，转染鼠源ASIC1a的细胞，细胞活力百分比为(78.9±2.1)%，转染人源ASIC1a的细胞活力百分比为(55.3±2.7)%，二者差异具有统计学意义(P<0.001)；运用ASIC1a特异性阻断剂PcTx-1，可显著性增加细胞活力百分比(P<0.05)。

与鼠ASIC1a相比，###：P<0.001，n=4；鼠ASIC1a，与pH6.0相比，*：P<0.05，n=8；人ASIC1a，与pH6.0相比，**：P<0.01，n=8。图4 转染人源ASIC1a 的CHO细胞活力

2.5 人源ASIC1a在CHO细胞膜表达 结果显示(见图5)，人ASIC1a膜蛋白表达量是鼠ASIC1a的3.5倍(P<0.05)，说明人源ASIC1a细胞膜表达更多。

Surface ASIC1a表示细胞膜上的ASIC1a的量，Total ASIC1a表示总ASIC1a的量，surface除以 Total代表ASIC1a往细胞膜上转运率，与鼠ASIC1a相比，*：P<0.05，n=4。图5 人源ASIC1a比鼠ASIC1a在细胞膜表达

3 讨论

前期对ASIC1a的研究，主要集中在啮齿类动物，对人源ASIC1a的研究较少，动物实验研究中，ASIC1a阻断剂显著改善缺血性坏死，但却没有基于该药理作用的药物投入临床，原因是由于ASIC1a特异性阻断剂PcTx-1是南美一种蜘蛛提取的毒素，不宜大量运用于人体，并且 PcTx-1大量的合成、稳定性以及能否透过血脑屏障这些问题都给其临床应用带来困难[11]。此外，人源与小鼠源ASIC1a存在2%氨基酸序列的差异，ASIC1a在不同物种间的表达、分布、亚单位结合、生理性质以及药理学性质都存在差异[12]。

本文通过对COS7细胞/CHO细胞/原代皮层锥体神经元转染人或小鼠ASIC1a质粒，经酸pH6.0处理之后，对比细胞凋亡情况。发现与转染小鼠源ASIC1a的COS7细胞和神经元相比，转染人源ASIC1a的COS7细胞和神经元，由酸引起的细胞PI阳性细胞比率更大，细胞死亡率更高，细胞活力更低，且ASIC1a特异性阻断剂PcTx-1能显著逆转由酸引起的细胞凋亡。因此得出结论，人源ASIC1a比小鼠源ASIC1a介导由酸引起的细胞凋亡越大。

本文通过PI染色、MTT实验研究酸引起的细胞凋亡，最好再通过细胞流式或者检测细胞因子的水平，比如，IL-1β、TNF-α、Caspase3等[13]，这都是未来我们需要完成的实验。此外，在脑缺血病理状态下，ASIC1a介导细胞内钙超载，可以通过钙成像实验比较人源与鼠源ASIC1a引起细胞内钙离子浓度变化情况。本文的图5结果说明人源ASIC1a比鼠ASIC1a在细胞膜表达更多，那么我们可以假设人源ASIC1a比鼠源ASIC1a介导的膜电流更大，介导细胞内钙离子浓度更高，这些假设都将在我们接下来的实验中进行验证。

通过这一系列的基础研究，我们明确ASIC1a介导酸引起的细胞凋亡，进一步通过研究ASIC1a介导细胞凋亡的分子机制，对药物的理性筛选更有指导意义，为防治缺血性脑卒中提供重要的理论依据。