抗铜绿假单胞菌生物膜形成相关因素及干预药物的研究进展

王洪曼，黄铮铮，李天牧综述，高伟，李倩审校

(1.潍坊医学院医学检验学系，山东 潍坊 261053；2.山东省高密市人民医院检验科，山东 潍坊 261500；3.潍坊医学院临床医学院，山东 潍坊261053)

铜绿假单胞菌在自然界中呈广泛分布状态，除了水、空气、土壤中，还常分布于人体的皮肤、肠道和呼吸道等与外界相通的部位[1]。铜绿假单胞菌是一种革兰阴性杆菌，具有条件致病性，可导致多种感染，占非发酵菌临床分离率首位，常见于医院感染[2]。由于抗生素的滥用等一系列原因，铜绿假单胞菌的耐药性目前与日俱增，使其成为临床治疗和预防工作中的一个难点。铜绿假单胞菌产生药物耐受性的途径包括产生药物灭活酶或药物修饰酶，细菌细胞膜通透性的改变，通过改变外排泵的机制，生物膜的产生等[3,4]。其中，生物膜的产生可使铜绿假单胞菌更加适应不良的生活环境，对抗生素具备更强的耐药性，导致感染铜绿假单胞菌后进行临床治疗变得更加困难[5]。由于近年来在临床治疗中许多生物医学材料的出现，为该菌形成生物膜提供了良好的寄生环境[6]，导致感染和耐药的发生率进一步增高。现在，针对抗生物膜相关药物的研究日益增多，如何围绕生物膜进行抗铜绿假单胞菌感染的治疗是目前临床研究的热点之一，抑制生物膜的合成或加速其分解可有效解决铜绿假单胞菌感染的治疗难题[7]。本文将对抗铜绿假单胞菌生物膜形成相关因素及干预药物的研究进展进行分析和综述。

1 铜绿假单胞菌生物膜及其结构

Costerton于1978年首次提出了生物膜(Biofilm)这一名词，并提出了细菌生物膜的相关理论。细菌分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等胞外多糖，使其相互黏连，并与细胞表面受体结合，吸附细胞，形成膜样的结构，称为生物膜[8]。铜绿假单胞菌成熟生物膜的主要组成结构为蘑菇样或柱样的亚单位，亚单位包括头部、茎部和根部三部分，茎部-茎部、头部-头部、茎部-头部之间可形成水通路，类似原始的循环系统，可用于细菌营养物质和代谢废物的摄取和分泌[9]。

2 抗铜绿假单胞菌生物膜形成相关环境因素

2.1 氧浓度对铜绿假单胞菌生物膜的影响 各研究结论表明，铜绿假单胞菌生物膜的形成离不开氧浓度的作用，两者呈正比关系[10]。在一定范围内，氧浓度的增加促进了藻酸盐的产生，从而导致铜绿假单胞菌产生的生物膜数量逐渐增加，当氧浓度为50%时，生物膜的产生量达到最高值。因此提供低氧环境可抑制铜绿假单胞菌生物膜的生成，影响细菌生长。

2.2 铁离子对铜绿假单胞菌生物膜的影响 铁离子可对生物膜的稳定性进一步加以巩固，影响生物膜形成中的静电作用，对铜绿假单胞菌生物膜的形成发挥了重要作用，并且可导致生物膜的聚集效应[11]。Ehud等[12]的研究表明，铜绿假单胞菌在低铁条件下，可分解部分生物膜，可以看出铁离子在稳定生物膜方面的作用；Singh等[13]通过实验研究证实，铜绿假单胞菌生物膜中如存在乳铁蛋白，可将其中的铁离子进行螯合，使生物膜在形成过程中保持移动状态，同时不易定植、黏附，降低细菌聚集的机会，有效降低生物膜的形成。

2.3 镁离子对铜绿假单胞菌生物膜的影响 镁对于细菌的早期黏附起促进作用，还可使生物膜的结构在初期和成熟期时更加复杂，因此导致生物膜越发难以消除[14]。再者，镁离子可以稳定细菌细胞壁中的脂多糖，从而在某些抗生素的使用过程中阻止其进入细菌细胞内，无法发挥杀菌的作用[15]。因此，降低镁离子浓度可以协同清除铜绿假单胞菌的生物膜，并降低细菌抵抗抗生素的能力。

3 抗铜绿假单胞菌生物膜形成相关化学药物

3.1 抗生素 不同的抗生素对生物膜的影响不同，从清除生物膜的角度来说，氟喹诺酮类的作用最强；而从生物被膜的穿透性角度来说，大环内酯类药物在亚抑菌浓度时具有抑制生物膜的生成和破坏生物膜结构的作用[16]。低浓度红霉素和阿奇霉素能抑制群体密度感应(Quorum-sensing，QS)系统，降低藻酸盐的产生，广泛应用于临床的抗生物膜治疗[17]。临床上现在多用药物联合治疗铜绿假单胞菌生物膜感染，如阿米卡星与大环内酯类药物联用对铜绿假单胞菌生物膜形成具有显著的抑制作用[18]。

3.2 环二鸟氨酸 环二鸟苷酸 (cyclic diguanylate，c-di-GMP)是一种细菌中存在的信使分子，它参与调节多种生理功能，并在一定程度上影响生物膜的形成[19]。王岚等[20]通过基因同源重组，构建出铜绿假单胞菌环二鸟苷酸降解酶磷脂酶D的基因突变株。与野生型相比，基因突变菌株形成生物膜的能力明显强于野生型，生物膜内细菌聚集能力强于野生型，且有纤维素样物质存在和积累。原因可能是由于基因突变，使合成c-di-GMP的二鸟苷酸环化酶被特异性磷酸二酯酶降解减少，导致c-di-GMP增加，使细菌聚集形成微克隆，有利于在导管材料表面形成生物膜。因此，c-di-GMP增加可能导致铜绿假单胞菌耐药性增强。

3.3 壳聚糖及其衍生物 壳聚糖 (chitosan，CHI)是甲壳素经过脱乙酰化后形成，来源天然，具有抑菌，生物可降解及良好的生物相容性等特点。有研究表明，CHI衍生物壳聚糖季铵盐(quaternized chitosan，QCHI)可以有效抑制病原微生物的生长和扩增。研究发现[21]，CHI和QCHI均能有效抑制铜绿假单胞菌的生长，减少其生物膜的形成。与生物膜形成相关的多种基因的表达也可受到QCHI的干预，进而实现抑菌的效果。

4 抗铜绿假单胞菌生物膜形成相关传统药物

4.1 黄芪苷 黄芪苷可以清热解毒、抗菌消炎，在临床上可用于消炎治疗 黄芪苷的毒副作用较小，抗菌谱广，可以对多数细菌产生良好的疗效。该药物主要通过提高生物膜对其的渗透作用，进而提高细菌细胞内药物浓度，使药物发挥更好的抗菌性能，提高临床治疗效果[22]。

4.2 鱼腥草素钠 鱼腥草素钠是中药鱼腥草的活性成分，其衍生物可以有效抑制病原菌感染[23]。研究表明[24]，鱼腥草素钠可清除铜绿假单胞菌的黏附作用，阻碍其生物膜的形成。鱼腥草素钠可以通过对铜绿假单胞菌生物膜的清除作用，影响其生物膜的形成，同时可能引起铜绿假单胞菌形态变异，从而达到抑菌的作用。且和抗生素协同治疗，会有更好的效果[25]。

4.3 金银花 金银花是一种清热解毒的良药，其有效成分绿原酸和异绿原酸具有抑菌效果。袁秀丽等[26]研究发现，金银花水煎液在体外可影响铜绿假单胞菌生物膜的形成，从而抑制铜绿假单胞菌的生长。因此，传统药物也可影响铜绿假单胞菌生物膜的形成，要合理运用其良好效果?

4.4 大蒜素 大蒜素是大蒜的主要有效成分，具有抗菌消炎、抗氧化和调节机体免疫功能等多项功能。Lihua等[27]观察了铜绿假单胞菌在大蒜素的影响下，黏附情况及胞外多糖的合成情况。结果显示，在高浓度大蒜素影响下，细菌的黏附率能力明显降低，粘附状态相对稀疏，且胞外多糖生成量降低。大蒜素可显著减少铜绿假单胞菌黏附及产胞外多糖的能力，进而有效抑制生物膜的形成。

4.5 云南白药 云南白药为具有抗菌消炎、活血化瘀功能的中成药，其成分中有多种中草药活性成分[28]。赵祖国等[29]前期研究结果表明，云南白药可影响铜绿假单胞菌的生长和生物膜的形成，其提取物通过干扰铜绿假单胞菌的QS系统、抑制铜绿假单胞菌分泌多种毒素达到治疗目的。

4.6 五倍子醇提液 陈雨等[30]观察到五倍子醇提液对铜绿假单胞菌生物膜内活菌数的降低有一定的促进作用，可清除生物膜内的细菌，且在一定条件下五倍子对铜绿假单胞菌生物膜有一定的清除作用，甚至是完全清除作用。张慧艳等[31]研制的一种抗皮肤感染的中草药复方制剂的组方含黄芪和五倍子，体外抑菌试验的结果说明该中草药复方制剂在抑菌方面有良好的功效，是一种合理运用中草药且效果优良的抗菌产品。

4.7 落叶松皮素 落叶松皮素是天然的铁螯合剂，来源广泛，存在于蕨类植物的叶子、落叶松树皮及大麦芽中，常用作防腐剂[32]，具有抗菌活性，对铁有很强的螯合能力，具有高效低毒的优点。在细菌生物膜形成初期，铁螯合剂落叶松皮素可抑制铜绿假单胞菌附着于塑料上；在生物膜由单层细胞发育为微菌落这一重要环节，落叶松皮素可增强铜绿假单胞菌IV型菌毛介导的颤搐运动，阻滞微菌落形成过程，阻止细菌生物膜成熟，阻碍其立体三维结构的发育，最终导致铜绿假单胞菌生物膜发育的减缓[33]。

4.8 白藜芦醇 QS系统在铜绿假单胞菌生物膜的形成和感染过程中发挥了重要的作用。研究[34]显示，在来源于买麻滕科植物的QS抑制剂——白藜芦醇存在的条件下，铜绿假单胞菌的生物膜对氨基糖苷类抗生素更敏感；白藜芦醇和氨基糖苷类抗生素对生物膜的结构造成了破坏；白藜芦醇能够抑制铜绿假单胞菌QS系统中两种重要信号分子的表达。表明白藜芦醇能显著增强氨基糖苷类抗生素(如妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星和奈替米星)对铜绿假单胞菌生物膜的作用，是治疗铜绿假单胞菌生物膜感染的潜在促进剂，可以恢复或增强氨基糖苷类抗生素的疗效。

4.9 蝶呤 蝶呤是蝶啶类化合物的一员。研究[35]证实，蝶呤可以引起细胞壁的裂解，对大肠杆菌和铜绿假单胞菌具有拮抗作用和抗菌活性。此外，还证明了蝶呤对生物膜的形成具有抑制作用，能够明显降低生物膜的形成量。因此，蝶呤作为一种良好的抗菌药物，可用于治疗各种致病性疾病，并具有被开发成未来抗耐药性细菌抗生素组成部分的潜力。

5 展望

通过抑制细菌的致病因子以达到治疗感染的目的，已经受到学者们的广泛关注。开发针对铜绿假单胞菌生物膜的抗菌药物或治疗方法，成为目前抗铜绿假单胞菌感染的研究重点之一。在铜绿假单胞菌生物膜形成的影响因素中，高氧浓度与高镁离子都有利于铜绿假单胞菌的生物膜的生成，并且，铁离子的存在能进一步巩固生物膜的稳定性，因此，减少氧浓度，去除镁离子、铁离子对于铜绿假单胞菌生物膜的形成有一定阻止作用。很多化学药物与传统药物都对抗铜绿假单胞菌生物膜形成有一定作用，其中传统药物在抗铜绿假单胞菌生物膜形成方面有良好的效果，为合理运用传统药物以及化学药物与传统药物相结合治疗提供了依据。随着治疗药物的进一步深入研究，其治病机制和耐药机制也会更加明确，在清除铜绿假单胞菌生物膜造成的感染方面也将会有新的进展。