透明质酸酶的研究进展

李 漫，刘建建，苏江伟，张 燕，杨莹莹，吴万福，郭学平

（华熙生物科技股份有限公司，山东 济南 260000）

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种广泛存在于脊椎动物组织细胞外基质中的酸性黏多糖，在创伤愈合、润滑关节、调节电解质转运等方面发挥重要的作用。HA的相对分子质量（Mr）大小影响其生理功能。目前，HA的降解主要有物理、化学、酶降解，通过物理或化学的方法反应条件剧烈，往往会破坏单糖残基结构，且非特异性降解糖苷键，而酶可特异性降解糖苷键，反应温和。

透明质酸酶（hyaluronidase）是一类主要降解透明质酸的糖苷酶。随着人们对透明质酸酶的生物学意义认识不断深入，越来越多的证据表明，其用途非常广泛，鉴于国内外的研究现状，本文主要对其分类、应用、不良反应进行综述，以期为透明质酸酶的研究提供交流。

1 透明质酸酶的分类

根据氨基酸序列的同源性及来源、最适反应pH值和透明质酸酶作用机制，透明质酸酶常被分为3类[1]。

根据目前的生产工艺及来源，分为动物睾丸来源、动物毒液、人工重组和微生物来源4大类，其中美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration， FDA）已批准上市的药品来自于动物睾丸和人工重组，前者提取自牛、羊等动物睾丸，后者则通过将人透明质酸酶基因序列导入细胞系培养而获得。微生物来源的透明质酸酶虽未作为药品报批上市，但已在各类基础研究中广泛运用。

1.1 动物睾丸透明质酸酶

哺乳动物牛、羊睾丸是睾丸透明质酸酶的主要来源。2004年至今，FDA相继批准了3种透明质酸酶制剂：牛型透明质酸酶、羊型透明质酸酶和重组人型透明质酸酶，适应证包括与局部麻醉药（主要是眼科用药）联用以增强药物弥散，改善麻醉效果和维持时间及辅助皮下灌注。此外，国内适应证还包含骨关节炎的治疗。虽未标注用于透明质酸填充术后的不良反应治疗，但其在透明质酸填充术后所致不良反应的治疗中发挥了不可替代的作用。

1.2 人工重组透明质酸酶

人类基因组包含6种透明质酸酶，其中HYAL-1（HYAL，Gene of Hyaluronoglucosam inidase）、HYAL-2、HYAL-3、HYAL-4、HYAL-P1 和 PH20/SPAM1。目前关于人透明质酸酶的研究主要集中在HYAL-1、HYAL-2及PH20[2]。

动物组织提取的透明质酸酶仍存在低纯度、高免疫原性等问题，限制了其癌症治疗中的研究和应用。利用基因重组技术将人透明质酸酶基因PH20整合到体外培养的细胞中，成功表达了重组人透明质酸酶rHuPH20（recombinant human hyaluronidase），纯度高且降低了高免疫原性的风险。2005年12月，美国药监局批准rHuPH20上市，适应症是作为佐剂增加其他注射药物的分散和吸收[3]。但当时的rHuPH20由于半衰期短，易被降解。聚乙二醇重组人透明质酸酶PEGPH20的研制成功将rHuPH20的半衰期从不到3 min，延长至10.3 h[4]。PEGPH20已于2016年上市，但国内在人工重组透明质酸酶制剂上仍为空白。2017年6月，FDA已批准rHuPH20与利妥昔单抗联用于淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病的治疗。目前，PEGPH20结合单抗药物或其他抗肿瘤化疗药物的研究也有报道[5]。

国内对于此酶的研究也从未停滞。姜廷等[6]探究rHuPH20促皮下注射药物的扩散能力，以台盼蓝模拟联用药物作为可视化示踪剂，研究rHuPH20对皮下注射药物扩散速率的影响以及在替代药物静脉输液方面具有潜在应用价值。

1.3 微生物透明质酸酶

动物来源的透明质酸酶是有限的，微生物发酵制备透明质酸酶不受原料来源的限制。微生物来源的透明质酸酶虽暂未开发成药品，但已应用于寡聚透明质酸和低分子透明质酸的制备及各类基础研究中。寡聚透明质酸（Oligo-HA）是指Mr小于10×103的HA，低分子透明质酸（LMW-HA）一般指Mr在104～106，均在医药及化妆品领域具有良好的应用前景。

目前，市售的Oligo-HA或LMW-HA来源于化学法降解和酶解法，化学降解法反应条件剧烈，对制得的产物生物活性有一定影响；酶解法条件温和，不对其结构造成破坏。有报道将HA分离纯化后加入透明质酸酶降解，再经膜过滤、乙醇沉淀、脱水干燥等，工艺复杂且微生物来源的透明质酸酶发酵液酶活性较低，发酵液最高酶活性约l02IU/ml，较难应用于工业生产。郭学平等[7-9]发现了一种芽孢杆菌产生的透明质酸酶，发酵液酶活性可达105IU/ml，纯化后可以达到106～107IU/ml。利用此酶降解HA成功制备了Oligo-HA或LMW-HA。经验证，此法生产的Oligo-HA或LMW-HA外用时可渗入皮肤表皮层，供给皮肤营养和水分，防止皮肤老化，还能防止紫外线的伤害，修复晒伤的皮肤细胞，可用于化妆品中；口服时易于吸收，不仅可清除自由基，活化皮肤细胞，同时有良好的增强免疫功能和抗衰老功能，可用于食品和保健品中；此外，还有促血管生成、细胞免疫活化和促进骨生成的作用，对治疗细菌性角膜溃疡也有良好的疗效，可用于医药领域。此发明还提供了一种重组制备此透明质酸酶的方法，利用此发明生产的透明质酸酶酶活性高、热稳定性及pH稳定性高，显著降低生产成本，目前已实现了全球首家酶切法生产Oligo-HA及LMW-HA的产业化。

近年，学者对产透明质酸酶的微生物进行了总结[10]。产透明质酸酶的菌株的研究多集中在节杆菌、巴斯德杆菌、兽疫链球菌、芽孢杆菌等[11-15]。为获取编码透明质酸酶的基因序列，解析了一系列透明质酸酶的氨基酸序列，研究相对透彻的是肺炎链球菌和无乳链球菌分泌的透明质酸酶[16-17]。有关芽孢杆菌产透明质酸酶的氨基酸序列也已被解析[7]。越来越多对细菌来源透明质酸酶的结构、机制、性质等的基础研究，为其下一步的研究和应用提供了方向。

2 透明质酸酶的临床应用

2.1 促进其他注射药物吸收和分布

最初，FDA批准透明质酸酶作为佐剂提高其他注射药物的吸收和扩散，皮下注射透明质酸酶可降解皮下的透明质酸，提高组织通透性，使皮下输液的渗出液或局部蓄积的血液加快扩散，降低局部药物浓度，加速外渗药物吸收，同时可减轻注射部位疼痛。

2.2 麻醉辅助剂

透明质酸酶与局麻药合用时，可加快麻醉的起效时间，减少局部浸润所致的肿胀；此外，还可能促进局麻药在体内的扩散和分布，增加局麻药在体内的吸收，从而增加全身反应发生的几率。

2.3 眼科方面的应用

关于透明质酸酶在眼科手术麻醉、白内障、青光眼、玻璃体视网膜疾病等方面的应用较多，总结为可减少局部麻醉药物使用量，降低因此带来的结膜水肿及眼压升高的风险；可加速局麻药物发挥效应的时间，加大麻醉剂扩散，增加手术安全性；白内障手术时，使用HA保护角膜和眼内组织，但术后常见暂时性眼压升高，白内障术中应用透明质酸酶，可预防后发性白内障发生；在青光眼滤过术中稳定眼压；在玻璃体视网膜手术中，探讨如何引导玻璃体液化，并较完全地后脱离以增加玻璃体视网膜手术安全性和成功率的研究已成为热点，透明质酸酶可使玻璃体液化，是辅助玻璃体切割最有应用价值的酶之一；在其他眼病，如类固醇性高眼压及甲状腺相关眼病中，均有积极的治疗作用[18]。透明质酸酶一直是眼麻醉手术中常见的添加剂，但也有人质疑其作为麻醉辅助剂在白内障手术期间的使用的必要性，并评估了在不存在透明质酸酶情况下麻醉结果的差异，提出为规避风险，建议在白内障手术进行中不需要添加透明质酸酶[19]。

2.4 医学整形美容并发症中的应用

透明质酸类注射填充剂在临床上可用于皱纹、凹陷、萎缩等，是一种理想的软组织填充剂。但当HA填充不当，则易引起炎性肉芽肿、皮下硬结、血管栓塞致组织坏死等[20]。透明质酸酶作为特异性水解HA的药物，在医学整形美容方面主要用于治疗注射HA术后并发症，尤其是各类血管危象，血管危象最终导致的病理结果是微循环障碍，也就是血管栓塞。如HA一旦进入眼动脉，易造成视网膜中央动脉栓塞，眼球后注射透明质酸酶，能降解血管内及周围组织的HA，临床上也有成功的案例[21]。出现栓塞征兆，要第一时间合理处理，最重要在于快速诊断和即刻使用高剂量的透明质酸酶[22]。Loh等[23]在发现出现右眶下动脉阻塞和皮肤坏死迹象时，立即实施高剂量透明质酸酶脉冲用药方案，成功阻止情况恶化，恢复了血管功能。

2.5 其他应用

透明质酸酶含量检测有较高的灵敏度和特异性，可作为早期癌症的诊断指标[24]；透明质酸酶可增强化疗药物的药效，加速治疗性抗体的吸收；促进胰岛素吸收；作用于神经细胞，改善毛细血管通透性，促进神经功能的恢复等。王新宏等[25]探讨鞘内注射透明质酸酶治疗结核性脑膜炎（TBM）疗效，治疗组加用鞘内注射透明质酸酶治疗，结果显示治疗组疗效明显优于对照组。

此外，透明质酸酶活性检测可作为一种有效的判断生育力的指标[26]。精子顶体内的透明质酸酶在受精过程中起重要作用，影响男性生育力。马晓萍等[27]分析88例精液标本，透明质酸酶的活性与精子P34H蛋白表达量呈正相关性，男性不育患者精子P34H蛋白表达量减少，透明质酸酶活性减弱。与其他药物联合应用也多有报道，崔稳丽[28]对126例结肠炎所致的慢性盆腔疼痛患者使用透明质酸酶联合抗生素治疗，发现透明质酸酶能显著提高抗生素对结肠炎所致盆腔疼痛的临床疗效。肿瘤疫苗一直是癌症免疫治疗研究中的热点，将纳米抗体与透明质酸酶结合，实现了体内抗肿瘤治疗效率的增强，为癌症免疫治疗提供了一种简单而有效的策略[29]。新的用途也在不断的被发现，Gomella[30]报道了第一例将透明质酸酶用于肠造口脱垂，以帮助减少肠造口手术手动按压失败后缺血性和阻塞性失禁。

3 透明质酸酶的不良反应

透明质酸酶不良反应发生率较低，不同的注射部位和注射剂量导致的过敏反应不同。在对以往的透明质酸酶相关文献回顾总结中[31]，眼周麻醉时，注射局部过敏反应发生率为0.05 %～0.69 %，主要症状有水肿、疼痛和瘙痒；施用高剂量透明质酸酶（200 000 IU）时，过敏性并发症风险可升至31.3 %。Kim[32]报道了一例在矫正HA填充过量的注射部位的过敏反应，注射部位红斑和肿胀，这种副作用有别于常见的透明质酸酶过敏反应。张元文等[33]探讨透明质酸酶治疗HA过度填充引起填充物积贮而导致局部出现皮下肿块或硬结的有效性及安全性，疗效满意，无严重不良反应。不同生物来源的透明质酸酶，也是过敏反应发生的原因，如动物组织提取来源相较于人工重组来源，杂蛋白含量高、免疫原性强，但目前临床上使用的产品绝大多数是动物组织来源。

为避免不良反应发生，需考虑是否进行过敏性皮试，透明质酸酶注射液的配制、注射的层次、注射量、注射针头的选择，避免注射炎症感染部位，与药物联用的注意事项、配伍禁忌、用药史，注射后护理等问题[20,33-34]。

4 展望

由于HA填充剂在医疗美容领域的广泛应用，透明质酸酶在治疗血管栓塞，尤其在栓塞致盲的案例中成功复明较罕见，临床上透明质酸酶如何与多种药物联合使用，如何处理此类状况仍需研究。随着对透明质酸酶研究深入，透明质酸酶在体内参与了炎症反应、创伤修复、毒素扩散、受精等，能特异性降解HA，因此开发酶抑制剂对于研发抗菌剂、抗肿瘤制剂、避孕药等奠定基础。此外，天然透明质酸酶因其体内循环半衰期短严重影响了药效发挥，开发设计长效透明质酸酶也是未来研究的热点。