RP-HPLC同时测定丹膝颗粒中丹酚酸B、丹皮酚和丹参素含量

李 燕，同晓霞

（陕西省延安市药品检验所，陕西 延安 716000）

丹膝颗粒具有平肝养阴、清热除烦等功效，常用于中风病中经络和脑梗塞恢复期瘀血阻络兼肾虚证、腰膝酸软等，在心血管疾病的临床应用较广，是由丹参、牡丹皮、天麻、牛膝、淫羊藿等十二味中药制成[1-11]。目前，国家标准中，仅针对丹参中的丹酚酸B含量和天麻中天麻素含量进行了控制[12]，未针对牡丹皮中的丹皮酚和丹参中的丹参素进行质量控制。为更有效地评价丹膝颗粒的质量情况，实验开发一种利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）同时测定丹膝颗粒中的丹酚酸B、丹参素和丹皮酚的分析方法，为完善和修订丹膝颗粒质量标准提供技术参考和依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260 infinity液相色谱仪， DAD检测器（安捷伦）；XS205 DU十万分之一电子天平（梅特勒）；SK3300LH型数控超声波清洗机（广州沪瑞明仪器公司）；HY-4型振荡器（天津泰斯特）；Milli-Q纯水仪（密理博）；T25涡旋混合器（艾卡科技公司）。

1.2 试药

丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，批号111562-201716）；丹参素钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号110855-201614）；丹皮酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号110708-201407）；丹膝颗粒（九芝堂，批号：20180425，规格：10 g/袋）。甲醇、乙腈（Merck公司，色谱纯）；甲酸（国药集团，分析纯）；纯化水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱：Agilent Zorbax eclipse SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：282 nm；进样体积：20 μl；流动相A：0.1 %甲酸溶液；流动相B：乙腈；丹参素、丹皮酚和丹酚酸B分离度均不得低于1.5；理论塔板数均不低于2000；梯度洗脱程序见表1。供试品溶液的HPLC图谱见图1。

表1 梯度洗脱程序

图1 丹膝颗粒供试品溶液的HPLC图谱

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备溶液的制备 分别取标准品丹酚酸B对照品、丹参素对照品和丹皮酚对照品各约50 mg，精密称定，置入同一50 ml量瓶，加约30 ml甲醇，使溶解，再用甲醇定容至刻度，摇匀，作为标准储备溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取丹膝颗粒10袋，取出内容物，置入研钵中研成细粉；精密称取研细后的样品约1.0 g，置入100 ml量瓶，加甲醇约70 ml，超声提取约20 min；取出放冷至室温，加甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取2.2.1项对照品储备溶液一定量，配制成质量浓度依次为2.0，4.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/ml溶液，加甲醇稀释至刻度，摇匀；按2.1项色谱条件，分别进样上述溶液。以浓度（X）与其对应的峰面积（Y）进行线性回归，得线性回归方程；以3倍信噪比计算3种待测化合物的检出限，结果见表2。

表2 线性关系考察结果

2.3.2 加样回收试验 取研细后的丹膝颗粒细粉，精密称取约1.0 g，同法称取6份，分别置入100ml量瓶中，再分别加入标准储备溶液2.0 ml，后续按2.2.2项供试品溶液配制方式进行前处理；按2.1项色谱条件，分别进样上述加标溶液，计算回收率及6次加标RSD值。结果见表3。

表3 加样回收试验结果

2.3.3 精密度与重复性试验 取同一批号丹膝颗粒样品约1.0 g，精密称定，按2.2.2项供试品溶液配制方法进行样品前处理，同法配制6份供试品溶液；再按2.1项色谱条件，分别进样上述供试品溶液，计算6份样品测定结果的重复性RSD：丹参素2.3 %、丹皮酚3.7 %、丹酚酸B 2.9 %；同一份供试品溶液连续进样6次，计算测定结果的精密度RSD：丹参素0.89 %、丹皮酚2.4 %、丹酚酸B 1.1 %。

2.3.4 溶液稳定性考察 取丹膝颗粒样品，按2.2.2项供试品溶液配制方法进行样品前处理，按2.1项色谱条件，供试品溶液分别在0，2，4，8，12，24 h进样分析。计算6次计算结果的RSD值分别为：丹参素1.1 %、丹皮酚1.9 %、丹酚酸B 3.2 %；结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 样品测定

取批号为20180407，20180423，20180814的丹膝颗粒样品，按2.2.2项供试品溶液配制方法进行样品前处理，再按2.1项色谱条件，进样分析，计算检测结果。见表4。

表4 样品检测结果

3 讨论

3.1 样品前处理方法的确定

考察了加热回流提取法和超声提取法对3种待测化合物进行提取前处理，处理液进液相色谱检测。结果表明，加热回流提取法提取3种物质回收率略高于超声提取法，但加热回流提取法提取到更多的杂质；超声提取法杂质峰最少，且杂质响应值更低，计算得到3种化合物的检出限更低。考虑到实验操作的简便等因素，故选择超声提取法作为样品的前处理方法。

3.2 检测波长的确定

取标准品丹酚酸B、丹参素和丹皮酚，分别配制质量浓度为20 μg/ml的标准溶液。取上述标准溶液，用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描，扫描波长在190～600 nm范围，得到3种物质的紫外吸收情况。丹酚酸B在254±2 nm、285±2 nm处有最大吸收；丹参素在225±2 nm，278±2 nm处有最大吸收；丹皮酚在228±2 nm，275±2 nm处有最大吸收。为使各物质响应值保持一致，故选择282 nm作为检测波长。

3.3 洗脱方法的确定

丹酚酸B、丹参素和丹皮酚3种化合物，极性差别比较大，极性由强到弱为：丹参素、丹皮酚、丹酚酸B。实验选择等度洗脱的方式，设定流动相为乙腈：0.1 %甲酸水溶液为20:80比例的条件下，丹参素、丹皮酚和丹酚酸B出峰时间依次为3.21，32.43，35.15 min。为提高分析检测效率，尽可能缩短分析时间的同时保证3种化合物有较好的分离，实验采用梯度洗脱条件对3种化合物进行分离，经过调试选择梯度洗脱条件见1.2项色谱条件。

本实验建立了一种利用RP-HPLC同时测定丹膝颗粒中丹酚酸B、丹皮酚和丹参素的分析方法，实验首选优化了前处理方法和色谱条件；并对方法的加样回收率、检出限、线性、重复性等进行了考察，结果表明该方法具有前处理简单、检出限低、检测结果准确等优点，为全面控制丹膝颗粒的质量提供技术参考。