慢性乙型肝炎治愈新药研究进展*

张 茜，胡 鹏

据2016年世界卫生组织报道，全球约有2.4亿慢性HBV感染者，每年约有65万人死于慢性HBV感染导致的肝硬化或肝癌[1]。2017年欧洲肝病研究学会对乙型肝炎治愈作出定义：（1）完全治愈（complete sterilizing cure），即血清HBsAg完全检测不到，HBV DNA彻底清除，包括共价闭合环状DNA（cccDNA）和整合的HBV DNA；（2）功能性治愈（functional cure），即在有限的治疗疗程结束后血清HBsAg和HBV DNA持续检测不到，伴或不伴HB－sAg血清学转换，残留的肝损伤恢复，远期发生肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的风险降低；（3）部分治愈（partial cure），即在有限的治疗疗程结束后血清仍能检测到HBsAg阳性，但持续检测不到 HBV DNA[2，3]。

治疗慢性乙型肝炎的抗病毒药物主要分为两类：（1）核苷（酸）类似物（nucleos（t）ide analogues，NAs]和（2）干扰素类（IFNs）[4，5]。失代偿期肝硬化、肝衰竭、合并重要脏器功能障碍、自身免疫性疾病和心理疾病等患者禁用干扰素。在过去十年里，国内外学者为了追求更多的患者实现临床治愈，对NAs和IFNs联合、序贯、联合/序贯治疗进行了探索，发现治疗 48周 HBsAg清除率为 14.4%，96周为20.7%[7]。新型的抗病毒药物主要分为两大类：①作用于乙型肝炎病毒生活周期各靶点的直接抗病毒药物；②免疫调节剂：主要是免疫激活剂，能改善固有免疫和适应性免疫功能，从而清除病毒。

1 直接抗病毒药物

1.1 HBV进入肝细胞抑制剂 HBV进入肝细胞主要通过黏附于硫酸乙酰肝素蛋白多糖，HBV的前S1肽段与跨膜转运蛋白钠-牛磺胆酸盐共转运多肽（NTCP）特异性结合，包膜融合，HBV核衣壳释放至感染肝细胞的细胞质中。因此，抑制病毒进入制剂主要分为四类：中和抗体、吸附抑制剂、NTCP底物和不可逆的NTCP抑制剂[8]。其中NTCP抑制剂Myrcludes B正进行Ⅱ期临床试验，主要观察该药物联合或不联合Peg-IFN在乙型肝炎合并丁型肝炎共感染患者治疗48周的抗病毒疗效。研究结果显示在30例联合治疗患者中有29例HDV RNA下降大于2 lg copies/ml，其中15例检测不到病毒RNA，而在单药治疗的30例患者中仅有15例HDV RNA下降大于2 lg copies/ml，其中4例检测不到病毒核酸。该药对于HBsAg的下降没有明显影响，主要抑制HBV cccDNA在非感染的肝细胞中的合成，因此可能在预防母婴垂直传播或肝移植患者再感染方面更有意义[9]。

1.2 靶向作用于HBV cccDNA 包括破坏和损伤cccDNA和使cccDNA功能性沉默。研究发现IFN-α、淋巴毒素-b受体激动剂和T细胞衍生的细胞因子（即IFN-γ和TNF-α）可以非溶解方式从感染细胞的细胞核中特异性地清除cccDNA[10-12]。核胞苷脱氨酶（APOBEC3A或APOBEC3B）被招募到cccDNA，经过脱氨基作用增加cccDNA分子敏感性并使其降解。另外，分子剪刀，如锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）或者近年来发现的基于CRISPR/Cas9的基因编辑法似乎在直接靶向并减少cccDNA病毒库方面都是潜在的工具[13，14]。在今后的试验中，需要进一步检测脱靶效应和细胞毒性等。在功能性沉默方面，基因组表观遗传修饰能阻碍cccDNA转录活性并关闭病毒蛋白表达。但这些作用不具有特异性，因而可能对宿主细胞造成不良反应[15]。HBV X蛋白（HBx）可通过Smc5/6限制因子降解和抑制cccDNA转录和复制[16]。基于以上作用机制的药物也在临床前研究阶段。

1.3 靶向作用于病毒转录本 在动物模型和人体试验，已广泛开展RNA干扰技术抑制HBV复制研究。目前有 ARB-1467、ARB-1740、RG-6004、AROHBV和ARC-520等多种小干扰RNA（siRNA）处于临床前或早期临床研究中。ARB-1467是一种新型RNA干扰药物，通过专有的脂质纳米粒子（LNP）技术实现干扰。在ARB-1467与NAs联合治疗的IIa期临床试验中，患者对该药物耐受性良好，并使所有受试者血清HBsAg水平降低。在11例HBeAg阴性患者（HBsAg≤1000 IU/ml），给予每两周静脉给药一次，有7例（64%）在治疗10周HBsAg降低≥1 lg u/L[17]。箭头公司研制的ARC-520能沉默cccDNA表达，Ⅱ期临床试验结果显示该药在患者体内能安全耐受，在HBeAg阳性初治患者采用ARC-520治疗后HBsAg、HBeAg和HBcrAg明显，在HBeAg阴性组和HBeAg阴性NAs经治患者组HBsAg下降幅度稍低[18]。ARO-HBV主要作用于2.1 kb的S段和0.7 kb X段，能够减少所有HBV mRNA和整合的HBV DNA的产生，纳入HBeAg阳性患者11例和HBeAg阴性患者13例，每月给予ARO-HBV siRNA 1次，共给药3次，在给药后1 d发现HBeAg阳性患者HBsAg水平下降2.1 lg copies/ml，HBeAg阴性患者 HBsAg水平下降 1.8 lg copies/ml，而HBV DNA、HBV RNA、HBcrAg均有不同程度的下降[19]。该技术有可能发生脱靶、载体带来的毒性反应和模式识别受体引起的免疫激活效应风险,需要在今后的实验中探索解决。

1.4 靶向作用于核衣壳的组装和前基因组RNA的包装 核衣壳的形成和前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）的包装是病毒生活周期中的关键步骤。因此，针对该阶段进行抑制或调节在乙型肝炎治愈方面起着重要作用。HBV核心蛋白不仅涉及病毒基因组的转运、pgRNA包装和衣壳的组装等，还涉及cccDNA染色质和稳定性的调节、病毒RNA的输出和固有免疫的调节。目前，已有几种非核苷小分子核心蛋白组装抑制剂，主要通过加强蛋白与蛋白之前的相互作用，抑制pgRNA衣壳化[3]。JNJ-6379是美国杨森公司开发的衣壳组装调节剂，正处于Ⅱ期临床试验。试验分为安慰剂、25 mg、75 mg、150 mg和250 mg五组，每日口服给药一次，共给药28 d。在75 mg和150 mg组，38%患者HBV DNA低于检测下线；在250 mg组，56%患者HBV DNA低于检测下线。随着剂量增加，患者对该药的耐受性依然良好，抗病毒效果强，在大剂量下可能会破坏衣壳的形成，从而阻碍cccDNA的补充[20]。另一种衣壳抑制剂ABI-H0731在Ⅱ期临床试验中纳入了HBeAg阳性和阴性非肝硬化患者，其中亚洲人群大于90%，口服给药每日一次，连续给药28 d。检测HBV DNA水平较基线下降4.1 lg copies/ml，但该药对于HBeAg和HBsAg水平没有影响。停药后出现了病毒学反弹，但没有出现生化指标的改变[21]。另外，尚处于Ⅰb期临床研究的药物NVR3-778显示出较好的抗病毒活性，患者血清HBV DNA、HBV RNA和HBsAg水平均有所下降，与Peg-IFN联合效果更佳[22]。AB-423临床前研究显示对于感染动物模型有强效抗病毒活性，联合恩替卡韦能增强抗病毒活性，后续的临床研究正在进行中[23]。

1.5 靶向作用于HBsAg 核酸聚合物可以减少HBsAg的分泌，使外周血HBsAg水平降低，从而极大的促进宿主免疫功能的恢复，达到清除病毒的目的。临床试验纳入REP2055单药治疗患者8例，REP2139单药治疗患者12例，另外9例短期联合Peg-IFN或胸腺肽α-1治疗，结果显示单药治疗的两组患者血清HBsAg下降2～7 lg u/L，HBV DNA下降3～9 lg copies/ml，并且出现了HBsAb（10～1712 mIU/ml），短期联合治疗组有8例出现了HB-sAg消失，9例患者 HBsAb滴度均持续升高[24]。REP2139联合Peg-IFN治疗乙型肝炎、丁型肝炎共感染的临床试验纳入12例患者，患者每周接受一次REP 2139 500 mg静脉注射，持续15周。然后，每周一次REP 2139 250 mg静脉注射、Peg-IFNα-2a 180 μg皮下注射，联合治疗15周，接着用Peg-IFNα-2a 180μg每周一次单药治疗，持续33周。6例患者在治疗结束时HBsAg水平低于50 IU/mL（均＜0.05 IU/ml），其中 5例在随访 1年结束时保持了这种抑制状态。6例患者在治疗结束时HB-sAb滴度超过10 mIU/ml，并有5例患者保持到随访1年后。9例患者在治疗结束时抑制了HBV DNA（＜10 IU/ml），7例患者维持到随访结束时。11例患者在治疗期间HDV RNA转阴，治疗结束时仍有9例患者HDV RNA阴性，其中7例患者在1年随访结束时仍为阴性。到1年随访结束时，在12例患者中有9例发生血清氨基转移酶正常化[25]。

1.6 HBV DNA聚合酶 新一代的NAs增强了抗病毒功效，但其口服生物利用度和长期抗病毒耐受性等问题，除了替诺福韦艾拉酚胺已经上市外，CMX157、AGX-1009、Besifovir和 Lagociclovir valactate还处于临床试验阶段[26]。此外。去年吉利德公司与Precision合作，利用能够精确识别DNA长序列的归巢核酸内切酶靶向作用于DNA序列，实现基因编辑效率的最大化和脱靶效应的最小化，该酶将是治愈HBV感染的另一候选分子。

2 免疫调节剂

2.1 治疗性疫苗 治疗性疫苗旨在诱导功能上有效的抗病毒免疫反应，克服已经建立的HBV特异性T细胞的耗竭。目前的治疗性疫苗主要包括伴或不伴有强效佐剂的常规HBsAg疫苗、T细胞疫苗、HB-sAg和人类抗HBs免疫复合物、表达HBV抗原凋亡细胞、DNA疫苗和表达HBV蛋白病毒载体的疫苗[3]。酵母来源的HBsAg免疫复合物（YIC）疫苗已进入Ⅲ期临床试验，其在健康人群和慢性乙型肝炎患者使用的安全性在Ⅰ期和Ⅱa期临床试验中得到了证实[27]。YIC在双盲、安慰剂对照的Ⅱb期试验中显示出对慢性乙型肝炎患者的有效性，但是在Ⅲ期临床试验中结果并不理想[28]。在治疗组和安慰剂对照组患者病毒载量和肝功能的恢复情况结果相似[29]。另一种疫苗GS-4774是基于热灭活的酒酿酵母表达HBsAg、HBcAg和HBxAg。在Ⅱ期临床试验纳入178例NAs经治患者，一组继续口服抗病毒药物，一组分别联合GS-4774每4周一次，用至20周，在治疗24周和48周检测HBsAg下降水平无明显差异，5例HBeAg阳性患者接受GS-4774治疗后HBeAg消失，而对照组无1例出现。3例使用GS-4774患者HBsAg下降大于0.5 lg u/L，没有出现HBsAg消失[30]。DV-601是一种含有HBsAg和HBcAg的疫苗，其Ⅰ期临床试验显示出安全性和免疫原性好，Ⅰb期纳入14例慢乙型肝炎患者，采用DV-601联合恩替卡韦抗病毒治疗，8例中有2例发生了HBeAg血清学转换，14个患者中有4例发生了HBsAg血清学转换，各组均观察到HBV DNA下降。在6例HBeAg阳性接受DV-601大剂量治疗的患者中有2例检测到HBc特异性IFN-γ T细胞反应，但后期临床试验没有继续开展[31，32]。HeberNasvac是含有HBsAg和HBcAg的疫苗 ，在完成对慢性乙型肝炎初治患者的Ⅲ期随机、开放、Peg-IFN对照临床试验中共纳入160例慢性乙型肝炎初治患者，与Peg-IFN治疗相比，该疫苗更安全、能耐受，表现出持续病毒学控制和转氨酶复常，在随访48周时HBeAg 血清学转换率较高[32，33]。

2.2 干扰素类 IFN-α在慢性乙型肝炎的治疗中已应用于临床，近年来研究发现IFN-α能抑制pgRNA衣壳化，增强cccDNA降解，并在cccDNA转录的表观遗传修饰方面发挥作用。IFN-α治疗HBV不同基因型疗效差异巨大，今后有望从该机制入手寻找新的治疗靶点[3]。

2.3 IFN基因激动剂的刺激物 IFN基因刺激物是细胞质DNA受体多重衔接蛋白和病原体识别受体识别细菌的第二信使，可能是激活固有免疫反应的潜在目标。干扰素基因激动剂的刺激剂也可以用作治疗性疫苗接种的佐剂。维甲酸诱导蛋白1不仅已被证实能诱导IFN和细胞因子的产生，同时也能通过识别pgRNA结构，抑制HBV复制。SB-9200是二核苷酸SB 9000的口服前体药物，能激活维甲酸诱导蛋白1和核苷酸结合产生含寡聚化结构域的蛋白质2，在动物模型中表现出抗HBV活性，同时能减少HBsAg的产生[3]。在临床试验中，对于HBV DNA和HBV RNA的抑制作用呈剂量依赖性，在HBeAg阴性患者组，给予SB-9200 100 mg治疗，血清HBV DNA和HBV RNA下降明显。在HBeAg阳性患者，血清HBV DNA和HBV RNA下降幅度均较小[34]。

2.4 病原识别受体 病原识别受体在固有免疫中发挥着重要作用。GS-9620是口服的Toll样受体7（TLR-7）激动剂，在慢性乙型肝炎病毒感染的动物模型中能较好控制外周血和肝组织HBV DNA复制，同时HBsAg也明显下降[3]，在使用GS-9620与TDF联合治疗的II期试验中，血清炎性细胞因子，如IFN-γ诱导蛋白（IP-10）和IFN诱导型T细胞α化学引诱物（ITAC），以剂量依赖性方式瞬时增加。干扰素刺激基因（ISG）mRNA转录物水平也以类似的剂量依赖性方式被诱导。然而，尽管存在免疫刺激的证据，但在治疗24周后血清HBsAg和HBV DNA没有显著下降[35]。

2.5 免疫检测点的调节 在慢性HBV感染人群，缺乏T细胞介导的反应部分是由于共抑制受体的过度表达，其中程序性死亡受体1（PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）和T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）研究较多。Nivolumab是一种针对PD-1的单克隆抗体，被批准用于治疗实体器官肿瘤和淋巴瘤。它可能会逆转慢性乙型肝炎感染的免疫功能障碍，在动物模型和人体离体研究的前期试验中已经得到证实。Ⅰ期临床试验纳入NAs经治HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者，静脉给予nivolumab联合或不联合GS-4774，均可产生血清HBsAg的适度降低，并且耐受性良好[36]。但需警惕这种方法可能会产生不受控制的暴发性肝炎和自身免疫性疾病，导致致命性的器官损伤[3]。另一种凋亡诱导剂APG-1387是凋亡蛋白拮抗剂的二价小分子抑制剂，目前正在进行I期开发[37]。

慢性HBV感染存在选择性免疫功能障碍，主要表现为缺乏成熟的记忆T细胞，HBV特异性T细胞的耗竭，T细胞扩增受损，细胞因子产生改变。此外，高病毒载量，持续暴露于大量的HBV抗原中可进一步使HBV特异性T细胞功能损伤[31]。要想获得乙型肝炎治愈也许单一用药难以实现，采取联合治疗的策略更可取。一方面要控制病毒载量，减少病毒复制引起的再感染，改善固有免疫功能；降低病毒抗原滴度，纠正免疫耐受；尽可能减少病毒复制模版cccDNA水平；另一方面，要恢复HBV特异性T细胞的反应性，增强体液和固有免疫反应，纠正免疫损伤，实现停药后的持久免疫应答。不同靶点的联合治疗可以提高耐药屏障，减少单药有效剂量，从而减轻药物不良反应。抗病毒治疗联合免疫调节剂可能是未来治愈慢性乙型肝炎的主流路线。