亚硝酸盐氧化菌及其生态位的研究进展

邢丽贞程成孔进

(山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南250101)

0 引言

氮循环是生态系统中物质能量循环转化的重要组成部分，与生物代谢息息相关，其中亚硝酸盐氧化菌NOB(Nitrite Oxidizing Bacteria)是氮转化中重要的一环，其基本功能是将亚硝氮转化为硝氮，提供自身所需能量的同时推动氮循环的进行，是生态系统必不可少的基本微生物，传统上，认为NOB是生态位相对单一固定的硝化菌。在经典的硝化二段理论中，NOB与氨氧化菌共同作用，将氨氮转化为亚硝氮，并进一步转化为硝氮，这也是水处理脱氮中的基础步骤和基本理论[1]。目前脱氮生物的研究多集中于氨氧化菌AOB(Ammonia Oxidizing Bacteria)或氨氧化古菌AOA(Ammonia Oxidizing Archaea)[2]与厌氧氨氧化菌[3]，对亚硝酸盐氧化菌的研究较少，主要有：(1)由于AOB或AOA所作用的氨氧化步骤对于新的脱氮技术尤为重要，成为了脱氮效率的主要限制条件；(2)NOB的生长速度较AOB更加缓慢[4]，难以得到用于研究的足够的生物量。近年来，随着生物检测新技术的应用，对NOB的研究有了进一步的发展，NOB的多样性及潜力也逐渐得到重视，而全程硝化菌[5]的发现让人们意识到需要重新认识NOB及传统的脱氮理论，对于NOB的生态位单一的认识也需要进一步提升。

1 亚硝酸盐氧化菌概述

1.1 亚硝酸盐氧化菌的种类

NOB是化能自养型微生物，除Nitrolancea hollandica外大部分是革兰氏阴性菌[6]。目前已知的NOB包含4个门，即变形菌门(Proteobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、Nitrospinae和绿弯菌门(Chloroflexi)[6]，共 7个属，即硝酸细菌属(Nitrobacter)、硝酸球菌属(Nitrotoga)、Nitrococcus、硝酸刺菌属(Nitrospira)、Nitrospina、Nitrolancea以及Candidatus Nitromaritima[6-7]。海洋中的大部分NOB属于Nitrospinae[8]。Nitrotoga大多分布在温度较低的环境中(10～17℃)[9]，有的可以在中温环境(24～28℃)中生存[7]。Nitrospira的分布较为广泛，是污水处理中最常见的硝化菌之一[10]。Nitrospira种类繁多，适应的温度范围也更大(10～28℃)[9]，有的可以适应更高的温度(60～65℃)，也是目前发现的唯一嗜热型NOB[11]。此外，新发现的全程硝化菌也属于Nitrospira[5，12]。NOB种类繁多，多样的生理特性使得其可以适应各种环境，广泛分布在海洋、土壤、淡水及一些人工系统中[8-11]。

1.2 亚硝酸盐氧化还原酶

亚硝酸盐氧化还原酶NXR是NOB在硝化反应中主要的作用酶，由3个亚基NxrA、NxrB、NxrC组成[13]，可以将亚硝酸盐氧化为硝酸盐并产生能量，维持NOB的生命活动，同样也可以将硝酸盐还原为亚硝酸盐。其中NxrA、NxrB可以作为标记物来检测未知NOB种类[13]。NXR按空间分布可分为细胞质NXR与周质NXR。Nitrospina与Nitrospira的NXR属周质NXR，而Nitrobacter则是细胞质NXR。NXR空间分布上的差异会造成能量产生上的区别，周质NXR的质子产生与消耗是从膜两侧发生的，易于质子动力势能PMF的产生，相对细胞质NXR而言，氧化等量的亚硝酸根可以产生更多的能量，高效的产能会使周质NXR型的NOB更能适应低浓度底物的环境[14]。

NXR的差异可以直观体地现在对于亚硝氮底物的亲和力上。用Km表示NOB对于亚硝氮底物的亲和力，Km小的NOB对亚硝氮底物的亲和力和利用效率更高，Km大的亚硝氮底物亲和力则相对较低，不同种属的Km范围有差异。分别测定2个典型的NOB属(Nitrospira和Nitrobacter)对于亚硝氮底物的Km，二者的Km值有显著差异，Nitrobacter的Km范围为49～544 μmol/L，高于Nitrospira的Km范围(9～27 μmol/L)[15]，这意味着Nitrospira对于亚硝氮底物的亲和力要大于Nitrobacter。这种特性会使Nitrospira在低浓度亚硝氮的条件下更具竞争力，成为优势NOB菌群。Nitrospira与Nitrobacter恰好分别对应了周质NXR与细胞质NXR，这很可能就是造成Km值大小差异的主要原因。此外，Km的差别也引出了r/K策略的推论，即底物利用策略的不同，可以通过不同NOB的Km将其粗略分为K型菌与r型菌，Km更小的Nitrospira是 K型，而Km更大的Nitrobacter就是r型。但这种分类都是相对的，如发现一株Nitrotoga Km为 25 μmol/L[7]，则可以将其归为K型菌(相对Km较大的Nitrobacter)，而有的Nitrotoga的Km可以达到 89 μmol/L[7]，相对Km为25 μmol/L的Nitrotoga，则更偏向于r型菌。

NXR的差异可能是不同NOB发展进化的结果。对比不同微生物中的NXR，发现细胞质NXR更接近于硝酸盐还原酶(NAR)，周质型NXR则与厌氧氨氧化菌中的NXR类似。前者可能起源自光能自养型微生物，而后者可能是厌氧/微氧非光能营养型微生物。Nitrospira缺乏一般好氧菌中存在的减少活性氧自由基危害的关键酶，如过氧化歧化酶，只能通过其他替代方式如细胞色素c过氧化酶和几种硫氧还蛋白依赖性过氧还酶等维持低氧环境，减少活性氧自由基的危害[13]。这种假设可以解答许多问题，如低效率细胞质NXR产生的原因，可能是光能自养微生物进化中NXR并未产生较大变化的结果。

2 亚硝酸盐氧化菌生态位研究

一直以来，认为NOB是一种以亚硝氮氧化提供能量、维持生存的严格化能自养型微生物，然而NOB种类繁多，进化多样性导致其具有多种生理特性差异较大的分支，具有巨大的代谢潜力，这对NOB自身的代谢方式、NOB与其他微生物的种间关系产生一定的影响，NOB的生态位也变得更加多样。

2.1 亚硝酸盐氧化菌的生物代谢

在早期的研究中就发现有NOB可以利用简单的有机物进行代谢，Nitrobacter可以在氧化亚硝氮产能的同时利用丙酮酸来代谢产能[16]，此外，Nitrospira也可以代谢丙酮酸而产生能量[17]。利用宏基因技术对Nitrospira进行测定，发现其具有编码多种代谢途径相关酶的基因，如氢气代谢与甲酸代谢的基因。将Nitrospira置于氢气条件下，仅以氨氮作为氮源培养(排除亚硝氮干扰)，菌体可继续生长，而去除氢气或氧气时则无法生长。FISH检测结果表明菌体并未受到氢营养细菌污染，说明Nitrospira可以纯粹以氢气氧化产能代谢生长，这种体系获得的能量(ΔG°＝-237 kJ/molH2)要高于传统的亚硝酸盐体系获得的(ΔG°＝-74 kJ/mol NO2-)[18]。

可能是因为受益于Nitrospira起源于厌氧菌，缺氧条件下的Nitrospira的代谢方式也多种多样。Nitrospira moscoviensis中含有甲酸代谢相关酶的基因[13]。Koch等[19]在缺氧条件下培养Nitrospira moscoviensis，发现其可以利用甲酸盐作为电子供体，硝酸盐作为电子受体，进行代谢活动，在添加过量甲酸盐的情况下将硝酸盐全部还原，而不添加甲酸盐时没有亚硝酸盐产生。证明Nitrospira moscoviensis可以用甲酸盐作为电子供体进行硝酸盐还原反应。有研究发现Nitrospira moscoviensis可以在缺氧条件下，以氢气作为电子供体把硝酸盐还原为亚硝酸盐[20]，这可能也是NOB反应底物的来源之一。研究结果得出了一个重要的结论：在缺氧或厌氧条件下，NOB可以通过自身的代谢提供亚硝氮维持正常生长，为Nitrospira在氮代谢的竞争中提供了巨大的优势。

Nitrospira与Nitrobacter可能进化自不同的微生物，这就造成了NOB多样化的碳代谢方式。卡尔文循环是大多数光能和化能营养型微生物的固碳方式，NOB中的Nitrobacter和Nitrococcus均采用此方式，然而Nitrospira的基因组中没有完整的卡尔文循环基因，反而具有逆柠檬酸循环的基因[21]，说明Nitrospira的固碳方式可能是逆柠檬酸循环，这也是微氧微生物中常见的碳代谢方式，而Nitrospira也是检测到的以这种模式合成有机物的唯一硝化菌属[13] 。

NOB除了为人所熟知的亚硝酸盐氧化产能之外，还具备了上述更多的代谢方式以适应多种环境，而这些新的代谢方式也改变了NOB在环境中单一的亚硝酸盐氧化的生态位，在特定环境条件下的NOB具有更加丰富多样的生态位。宏基因组学的方法为挖掘NOB的生态位潜力提供了很好的途径，提供了更多的研究方向与思路，与实验结合后得到了新的成果，可能还有更多未知的NOB代谢方式亟待发现。由于各种环境中亚硝氮浓度大都较低，NOB的生态位变化对于其生存竞争有重要的意义，多样的代谢方式可能也会影响NOB在污水处理过程中的定位。

2.2 亚硝酸盐氧化菌与其他微生物的种间关系

污水处理中，AOB可以将污水中的氨氮氧化为亚硝氮，作为NOB硝化的底物，两者共同完成硝化作用，然而实际上，两者的关系可能更为复杂。在氨氮浓度低的环境中，仍然存在一定量的AOB，这是因为有的AOB能够分泌脲酶，可将尿素分解为氨与二氧化碳，作为氨氧化的底物[22-23]；而一些NOB同样具有编码脲酶的基因[13，19]，所以这些NOB可能利用尿素产生氨供给AOB，然后由AOB产生亚硝氮反过来供给NOB。Koch等[19]在尿素作为底物的条件下将可以分泌脲酶的NOB与不产脲酶的AOB共同培养，发现两者可以共同生长并产生硝酸盐，证明了两者间的这种共同生长的作用关系。除了尿素外，氰酸盐也可以起到类似的作用。氰酸盐也是自然界中普遍存在的化合物，可以作为底物被各种微生物利用，部分NOB能够分泌氰化酶并将氰酸盐转化为氨与二氧化碳，而以氰酸盐为底物的AOBNOB体系的存在也证明了这一种间关系[24]。这种AOB-NOB氰酸盐体系与尿素体系的不同点在于，大部分AOB/AOA并不具有分泌氰化酶的基因[24]，因此可能是氰酸盐硝化的主要存在形式。

除了上述2种关系外，AOB与NOB之间还存在更多生理互补的现象。如铁是硝化细菌代谢必须的元素，而AOB对铁元素的摄取可能需要借助NOB完成。因为Nitrosomonas europaea等一些AOB并不含有编码铁载体的基因，也就无法直接摄取铁元素，但是却含有编码铁载体受体的基因[25]，即其可以通过与其他含有铁载体的微生物，如Nitrobacter和Nitrospira等作用来获得铁元素[13]。另外，两者之间可能存在群感效应，N.winogradskyi可以在细菌生长阶段分泌群感物质，调节菌体密度，这种物质的扩散可以引起硝化细菌间的种间作用[26]，有研究表明这种群体感应作用对于好氧硝化体系的形成有正面作用[27]。

产甲烷古菌是厌氧系统中常见的微生物，而某些古菌具有强大的环境适应力，可以分布在各种极端环境中[28]。AOA作为具有与AOB类似功能的古菌，其存在是氨氧化体系的重要一环，弥补了AOB在一些特殊环境中无法存在的不足。AOA与AOB之间，除了互补还有竞争关系[29-31]，而两者与NOB的关系也是氮循环中的重要组成部分。叶磊等[32]对白洋淀湖岸地带的氨氧化系统及氨氧化菌分布进行了研究，发现氨氧化优势菌随空间改变而发生变化，AOA与AOB共同组成了岸边氨氧化系统，而岸边地带的主要氨氧化菌群为AOA，氨氧化系统表现出的空间异质性较为明显。相较于多存在于陆地与淡水系统的AOB而言，AOA是已知的在地热环境中生存的好氧氨氧化菌，其分布更为广泛，除陆地淡水系统外，还分布于海洋热泉等环境中[33]。基于这些发现，可以推测存在中、高温下的AOA-NOB体系作为硝化的主要体系。有研究从堆肥设备中提取菌体来接种富集培养嗜热硝化菌，将经过350 d培养后的菌体转移到反应器中进行650 d的长期驯化，得到了高效稳定的AOA-NOB体系，该体系可以在50℃条件下进行稳定的硝化活动。在这些菌体中，CandidatusNitrososphaeragargensis占 17%，Nitrospira calida占25%，AOA与NOB的活性分别为198±10和 894±81 mg N/(g VSS ·d)[34]，通过碳同位素追踪，确定其营养方式为化能自养型。

NOB与异养菌之间也有着复杂的种间关系。早期已有研究表明，某些异养菌可以利用NOB产生的简单有机物进行生命活动[17]，反过来，在一些混合物中，NOB硝化产生的硝酸盐可以被异养菌在缺氧条件下还原为亚硝酸盐，扩散到好氧区重新被NOB利用，作为氨氧化的补充[35]。类似现象也存在于NOB种群内部，Nitrobacter可以将硝酸盐还原为亚硝酸盐，使其重新被NOB氧化，产生的亚硝酸盐作为氨氧化反应的补充，为NOB活动提供必要的底物，同时也可以解释一些区域中NOB数量远高于AOB的现象[35]。

基于多样的代谢方式，NOB并不仅仅与AOB具有简单的种间关系，这种关系可能涉及微生物生长代谢的各个方面，而AOA-NOB体系的存在可能更加广泛，甚至可以延伸至与其他微生物间的相互作用。NOB的生态潜力使得其与其他微生物间具有多样的种间关系，而不同的种间关系也赋予了NOB与以往认识所不同的生态位，新的生态位意味着有更高的生存竞争力来适应各种各样的环境。从现实意义的角度来说，NOB多样的种间关系让其可以在不同的污水处理系统中发挥更大的作用。

2.3 全程硝化菌

传统理论将硝化分为氨氧化与亚硝酸盐氧化两步。然而完全一步硝化将氨转变为硝酸盐的产生的能量(ΔG°＝-349 kJ/mol)要比任意两步硝化产生的(ΔG°＝-275 kJ/mol NH3和 ΔG°＝ -74 kJ/mol)高，故而理论上应该存在可以进行完全氨氧化的微生物，且有可能在较低的底物条件下存在[36]。近年来，相继有发现证明了全程硝化菌的存在。研究人员从俄罗斯一个1 200 m的石油勘探井底热水下的管壁生物膜上提取到了一种Nitrospira，这是最早发现的全程硝化菌之一[5]。通过对提取到的细菌进行富集检测，发现了这种全程硝化菌，鉴定发现其基因组中含有氨氧化与亚硝酸盐氧化的相关基因，其既可以利用氨氮加氧酶(AMO)和羟胺氧化酶(HAO)进行氨氧化，又可以利用NAR进行亚硝酸盐氧化，只是全程硝化菌中的这3种酶与AOB、NOB中的酶并不完全相同[5]。Kessel等[12]从与水产养殖系统相连接的一个滴滤池的厌氧区提取样本，并添加铵盐、亚硝酸盐、硝酸盐进行低氧富集培养，得到的菌群中厌氧氨氧化菌占45%，而类Nitrospira型菌占15%。两者存在对底物的竞争关系，产生这种菌体占比的原因可能是菌体间具有其他功能联系。基因组数据分析发现，有2种Nitrospira存在完整的氨氧化与亚硝酸盐氧化基因，但是并没有其他证据表明此类菌群中有AOB/AOA的存在，后续试验证明了这2种Nitrospira可能具有单步硝化的潜力[12]。由于全程硝化菌中的AMO与已知AOB中的AMO结构及编码基因并不相同，从而可以作为其存在的参考[5，12]，在没有被证明有完全氨氧化的能力之前，通过一般的16S rRNA或NxrB基因鉴定的方法确定NOB是否为全程硝化菌是很困难的，因而可以通过amoA的特异性来靶向鉴定[37]。通过宏基因组对比发现，全程硝化菌可能广泛存在于土壤、淡水等各种自然生态系统和污水处理、给水处理等人工系统中[5，12，38-39]。

Wang等[39]通过宏基因组技术从中国海南、新加坡以及美国加州的饮用水系统中的4个样品里都找到了全程硝化菌的存在，通过核糖体蛋白、amoA、hao以及NXR酶基因序列的分析得出其很可能属于全程硝化菌，证明其广泛存在于水处理系统中。

关于AOB与全程硝化菌对于氨氮的竞争，虽然全程硝化菌的氨氧化路径相比AOB产能更多，但是AOB可以迅速将氨氮转化，速率更快。通过模型模拟AOB与全程硝化菌在3种环境中的竞争，发现全程硝化菌相比AOB，对于氨氮的竞争并没有优势，而AOB生物量有大于全程硝化菌生物量的趋势，可能只有在低氨氮浓度的条件下，全程硝化菌的产能优势才会更为显著[40]。实际的条件可能更为复杂，还需要实验进一步验证。

全程硝化菌的发现完善了硝化的版图，解决了长久以来硝化理论中存在的问题，对于硝化微生物(AOA、AOB、NOB和全程硝化菌)中生态位的划分也提出了新的问题，许多硝化系统中实际作用的硝化菌也需要进一步确定。

3 展望

NOB作为生物圈中氮循环的主要参与者，种类繁多，丰富的基因决定了其可以适应各种不同的环境，所以分布广泛。NOB的进化差异导致了NXR的不同，Nitrospira的NXR与厌氧氨氧化菌的NXR的关系很可能是水平基因转移的结果，这种差异表现在与亚硝氮底物的亲和力上产生了r/K型菌的区别。NOB并不仅是一类专性亚硝酸盐氧化细菌，对其生态位的认识也不应局限于此，其具有更加多样化的营养方式，通过与包括AOB/AOA在内的各种微生物互相作用，来适应各种条件，在不同的环境中具有不同的生态位，这也是其分布广泛的重要原因。未来对于NOB的研究不应仅局限于AOB-NOB体系，应该从更加全面、多元的角度分析研究，以期做出更大的突破。

AOA/AOB-NOB以及全程硝化菌共同作用于硝化阶段，各种微生物间的协同竞争更为多样，硝化微生物中生态位的划分也更加多元。研究单因素及多因素对于这种新体系的影响，会对污水处理工艺实现高效的短程硝化反硝化与厌氧氨氧化产生实际的意义。污水处理系统等许多人工系统中的AOBNOB体系可能需要重新评估。鉴于全程硝化菌的存在，可能许多系统中起关键作用的NOB实际上是全程硝化菌，其同样起到了AOB的氨氧化作用。相比其他NOB与AOB的协同作用，全程硝化菌与AOB间存在明显的竞争，两者的竞争关系可能比模拟的情况更加复杂，还需要通过实验进一步探究。